Влияние условий обработки шкур толстолобика на структуру коллагена

Оригинал статьи доступен по ссылке.

Аннотация. Инфракрасная (ИК) спектроскопия в настоящее время является одним из основных методов анализа и идентификации органических соединений. Метод основан на пропускании инфракрасного излучения через изучаемый объект, что влечет за собой возбуждение молекул, заставляя их совершать колебательные движения. Во время этого процесса наблюдается ослабление интенсивности света, проходящего через образец. Поглощение происходит на длинных волнах, энергия которых сопоставима с энергией возбуждения колебаний в изучаемых молекулах. Это свидетельствует о наличии в молекулах образцов или функциональных групп. Тем самым можно спрогнозировать и узнать о возможном строении вещества. Авторами исследования предложен способ получения коллагенсодержащей основы. Подбор концентрации органической кислоты дает возможность получения продукта с необходимыми характеристиками. Основной задачей проведения эксперимента является охарактеристика структурных изменений в коллагеновом волокне в процессе получения гидрата коллагена. Инфракрасные спектры получены на каждую стадию, начиная с исходного образца и заканчивая конечным гидратом коллагена. Сравнительная характеристика коллагеновых молекул исходного и конечных образцов позволяет сделать вывод, что агрессивная среда в процессе получения гидрата нисколько не повреждает нативную структуру фибрилл коллагена. В процессе получения коллагеновых волокон происходит их разволокнение. В дальнейшем коллагновые основы подвергали гомогенизированию в среде с дистиллированной водой, используя соотношение: одну часть массы обработанных шкур толстолобика и три части воды. Получая эмульсию, обладающую высокой гидрофильностью, что создает условия для применения в разных формах в пищевой, косметической и медицинской промышленности.

Введение

В настоящее время ощущается нехватка пористых материалов из коллагена, которые активно используются в медицине, косметологии и пищевой промышленности Данные матери- алы должны обладать высокими показателями влагоемкости и при этом сохранять свойства природных биополимеров. Одним из таких материалов может быть коллаген – уникальный белок соединительной ткани животных. Он отличается высоким содержанием глицина, гидроксипролина, пролина, которые придают ему жесткость и прочность. Относится к фибриллярным белкам, образуя волокнистый материал. Коллагены способны набухать в водных растворах благодаря наличию функциональных групп [1].

Наибольший интерес в этом отношении представляет рыбный коллаген, в частности коллаген пресноводных рыб, благодаря особым реологическим свойствам, облегчающим его технологическую обработку (он более низкомолекулярный, чем коллаген животных, не требует обязательного гидролиза при переработке сырья, а материалы из него более эластичны). Однако данных о его взаимодействии с водой и водными средами недостаточно, а объект мало изучен. Кроме того, открытым остается вопрос о методах обработки коллагена для повышения его водопоглощающей способности.

В разное время разрабатывались различные способы получения и очистки коллагенсодер- жащих продуктов [2]. Но зачастую все методы включают в себя обработку сырья с использо- ванием агрессивных сред или же основаны на применении ферментных препаратов, которые дорого стоят, что приводит к увеличению стоимо- сти конечного продукта. В соответствии с постав- ленной задачей необходимо совершенствовать метод получения гидрата коллагена для достижения требуемых физико-химических показателей готового гидрата надлежащего качества, который сохраняет нативную форму и исключает денатурацию и деструкцию белковых фракций. Гидрат должен удовлетворять технологическим параметрам, необходимым для высушивания и получения губчатых коллагеновых основ с высоким показателем влагоемкости.

С помощью ИК-спектроскопии можно быстро и надежно определить наличие функцио- нальных групп таких, как карбонильная, гидрок- сильная, карбоксильная, амидная, амино, циано. Есть возможность определить непредельные фрагменты: двойные и тройные углерод- углеродные связи, ароматические или гетеро- ароматические системы [5–6].

Цель исследования – идентификация струк- туры изменения шкуры толстолобика в процессе обработки. На каждом этапе были изучены мор- фологические характеристики шкур, их спектры поглощения в инфракрасной области для оценки технологических параметров обработки.

Материалы и методы

В качестве объектов исследования использо- вались кожи рыб толстолобика. Рыбы вылавливали в осенний период массой 700–1500 г. Шкуры отде- ляли вручную в лабораторных условиях при предва- рительном снятии чешуи, отделении хвоста, головы, жабр, плавников, зачистки внутренней поверхности от жировых тканей и прирезей мышечной ткани.

Для дальнейшей обработки использовалась средняя часть шкуры. Сырье промывали водой, выдерживали в мыльном растворе 20–30 мин, затем промывали водой и заливали раствором перекиси водорода 3% и щелочи 2 %, смесь выдерживали в течение 1 ч, затем промывали и заливали раствором органической кислоты 1,5%, после чего выдерживали не менее 3 сут.

Фиксация обеспечивает стабилизацию ткане- вых структур и их уплотнение, прекращает аутолиз, стабилизирует локализацию структур. Механизм действия фиксаторов основан на коагуляции белков и стабилизации липидов.

Для получения коллагеновой основы исполь- зовались следующие реактивы:

─кислота уксусная для пищевой промышлен- ности по ГОСТ Р 55982–2014;

─раствор перекиси водорода по ГОСТ 177–88; ─гидроксид натрия по ГОСТ Р 55064–2012; ─мыло хозяйственное твердое 72% ГОСТ

30266–95;
На каждой стадии обработки шкура подвергалась исследованию ИК-спектроскопией. Структурные особенности по спектру поглощения в инфракрасной области идентифицировали на аппарате ИК-Фурье спектрометр MPA и Vertex 70. Фурье спектрометр MPA разработан для оптимизации работы и решения широкого спектра задач. Позволяет проводить исследования жидких образцов, работает в диапазоне 12 800–3 600 см-1 [5].

Результаты и обсуждения.

Для получения высушенного коллагена с сохранением пространственной структуры фибрилл необходимо получить гидрат коллагена с высокой вязкостью, меньшим гидромодулем и показателем PH, близким к нейтральному. Для решения данной задачи предлагается более глубокая очистка шкур и отделение более уплотненных участков шкур. Из строения плав- ников рыбы видно (рисунок 1), что в местах крепления и брюшной полости вид шкуры значи- тельно отличается более плотной структурой. Для подтверждения данной гипотезы проведены гистоморфологические исследования.

Рисунок 1. Предпочтительные области шкуры для выделения коллагеновой основы

Как видно из рисунка 2, черным цветом даны области с более плотной структурой, которые следует убрать, а для дальнейшего исследования берутся области, выделенные красным цветом. В данной области шкура более однородна, меньше мышечной и соединительной ткани, чешуя отделяется легче. Для оптимизации получения коллегановой основы были прове- дены исследования шкур толстолобика путем заливка по Ромейсу с модификацией:

 вместо бензол-парафина был толуол- парафин. Так быстрее растворяется;

 отмывка от парафина после нарезки была толуолом;

 толуольное просветление и потом заключение враствор полистирола втолуоле 0,04% и запайка в полистирол.

уплотнена, что приведет в процессе выделения к более низкому разволокнению, поскольку требуется увеличение концентрации кислоты, чтобы разорвать межфибриллярные связи.

Рисунок 3. Срез среднего участка шкуры Figure 3. Cut the middle section of the skin

В средних участках шкур наблюдается менее плотное расположение коллагеновых волокон, нити коллагена менее плотные и более рыхлой структуры. Это позволяет нам сделать вывод, что предпочтительно использовать сред- ние участки шкуры толстолобика в производстве коллагеновой основы (рисунок 3).

Были отобраны образцы исходной шкуры толстолобика в сравнении с каждой стадией обработки шкуры с полученным гидратом коллагена (рисунок 4). Следующей задачей было изучение структурных особенностей на всех этапах технологического процесса про- изводства коллагена.

 

Рисунок 2. приплавниковой зоны

участка

шкуры

Срез верхнего

Figure 2. Cut the upper portion of the skin at the fin zone

Как видно на рисунке 2, линии фибрилл коллагена расположены равномерно, структура

Рисунок 4. ИК-спектроскопия получения гидрата коллагена: 1 – кожа толстолобика; 2 – кожа после обработки NаОН, перекись водорода; 3 – кожа после обработки уксусной кислотой; 4 – гидрат коллагена

Figure 4. Infrared spectroscopy of collagen producing hydrate: 1 – leather carp; 2 – skin after NаОН treatment, hydrogen peroxide; 3 – skin after acetic acid treatment; 4 – collagen hydrate

55

Antipova L.V. et al. Proceedings of VSUET, 2019, vol. 81, no. 4, pp. 53-57 post@vestnik-vsuet.ru

Нами были изучены образцы шкуры коллагена на 3 стадиях обработки в сравнении с исходным образцом No 1 шкуры толстолобика.

Отбирались пробы на каждой стадии обработки шкур в размере 10 г, затем образцы помещались в спектометр.

Из первого спектра колебаний исходной шкуры толстолобика наблюдается от 3500 см-1 разноупорядоченных метил и метильных группы – СО-NH-, это свидетельствует об об- щей структуре белковых молекул. В исходном образце отмечен пик 1570–1515 см-1 NH амид II и колебания С-N, так и в пике 1638 см-1отно- сится к вторичным аминам.

На второй стадии после обработки переки- сью и щелочью эти группы исчезли. Это связано, скорей всего, с взаимодействием с перекисью водорода. Амид III наблюдается на пике 1245 см-1, пики 1378,1245 – амид II. Это говорит о том, что на участках амидных связей происходит обрыв цепей, и они могут взаимодействовать с водой. Следующие 5 пиков увеличиваются до 1790 см-1, что соответствует С=O карбоксильным группам, могут взаимодействовать с аминами. По всей видимости, происходит превращение карбоксиль- ных групп. После взаимодействия с NаОН число этих групп увеличивается. Просматриваются валентные колебания С2O в области 1250–1230. Это колебания ≡