Разработка технологии высокомолекулярного коллагена

Введение

Уникальный белок коллаген обнаруживается практически во всех тканях и существует в многообразных формах и разновидностях. Особенно богаты коллагеном соединительные ткани.

Соединительная ткань распределена по всему организму и входит в состав хрящей, сухожилий, связок, матрикса костей, почечной лоханки, мочеточников, «подстилает» кожу, служит для фиксации кровеносных сосудов, составляет основу межклеточного вещества в печени и мышцах. Она участвует в образовании каркаса и покрова всех органов, а также в их восстановлении после повреждений или травм. Таким образом, понятно, что соединительная ткань выполняет ряд жизненно важных функций, к которым относится опорная, питательная и защитная, помимо этого соединительная ткань обеспечивает интеграцию органов и клеток. Ее массовый выход составляет 16 % мясной туши промышленных животных, в связи с чем соединительная ткань является важнейшим компонентом мяса и мясопродуктов.

Существующие на сегодня сведения о коллагенсодержащем сырье [21, 24, 27] вызвали большой научный и практический интерес среди специалистов рыбоперерабатывающей отрасли в связи с выявленными свойствами рыбного коллагена [5, 18, 12]. Общих статистических данных по количественному содержанию коллагена в пресноводных и морских рыбах пока недостаточно, однако показано [21, 22, 23], что шкура рыб как один из главных источников коллагенов составляет 4,0...4,5 % массы тел прудовых особей.

Таким образом, такое коллагенсодержащее сырье для мясной и рыбной промышленности является огромным источником природного коллагена.

Актуальность темы исследования

Коллаген - распространенный многофункциональный белок, на базе которого исторически сложились направления применения в медицине, в косметической и пищевой промышленности. В последнее время вырос интерес к рыбным коллагенам, которые обладают рядом преимуществ по сравнению с наземными животными, что позволяет создать перспективную сырьевую базу и получить новые коллагеновые субстанции. Однако технология рыбных коллагеновых субстанций требует дополнительного научного обоснования в разработке технологических решений, поскольку реально могут обеспечить существенные потребности в различных секторах экономики.

В настоящее время доля производства коллагеновых белков в России составляет около 80% за счет импорта, 20% - отечественные. При этом отечественное производство не развито и представлено малыми и средними по мощности предприятиями, а также специализированными лабораториями. Производство коллагена в мире сосредоточенно в США, Китае, Японии и странах Евросоюза. В России производят коллагеновые продукты в основном из сырья животного происхождения. Разработка функциональных и специализированных ингредиентов занесена в федеральную программу «Развитие биотехнологии в России до 2020 г» и представляет огромный научный и практический интерес.

Коллагеновые белки сосредоточены в побочных продуктах рыбоперерабатывающих производств, что актуализирует направления по получению коллагеновых субстанций и неразрывно связано со снижением экологической напряженности окружающей среды.

Получение материалов на основе коллагена рыбного происхождения открывает перспективы развития рыбоперерабатывающей отрасли. Глубокая переработка отходов данной отрасли позволит получать продукты, которые найдут свое применение в различных отраслях промышленности, таких как фармацевтика, медицина, косметология, пищевое производство.

В Российской Федерации глубоким изучением коллагеновых белков и различных технологических форм в получении коллагеновых продуктов

внесли работы Л.В. Антиповой, А.И. Сапожниковой, Меспоровой, О.П. Дворяниновой, И.А. Глотовой, Ю.В. Болтыхова, Н.В. Черниги, Э.М. Расулова, В.И. Воробьёва, И.М. Чернухи, И.А. Рогова и др. Среди зарубежных ученых значительный вклад внесли такие иностранные ученые как Батечко С.Л., Андриюк Т.А., Lillian Rich; Peter Whittaker, BoAn, Yu-ShanLin, Barbara Brodskya, Victoria Juskaite, Yang Li, Zhao Qin, Boi Hoa San и др.

Несмотря на достаточно большой объем экспериментальных данных, технология рыбных субстанций требует углубления и расширения научных данных, обосновывающих функционально-технологические свойства коллагеновой субстанции, разработки условий получения различных форм и разновидностей коллагеновых продуктов и полупродуктов для различных отраслей экономики.

Цель работы - Обоснование условий получения высокомолекулярного коллагена и материалов на его основе, средств и продуктов с высокой степенью влагоемкости, дезодорирующими и сорбционными свойствами для жизнеобеспечения человека, профилактики и лечения заболеваний.

В рамках поставленной цели решались следующие задачи:

• исследовать гистоморфологические свойства рыбных шкур различных топографических участков, усовершенствовать технологию получения коллагеновых субстанций с обоснованием параметров и режимов обработки рыбных шкур;

• определить и проанализировать свойства коллагеновой субстанции, полученной по усовершенствованной технологии;

• определить условия и доказать сохранение нативной структуры рыбного коллагена на всех этапах получения коллагеновых субстанций;

• оценить перспективы применения коллагеновых материалов и сред в различных отраслях экономики, включая косметологию и медицину, и получение продуктов питания с профилактическим и лечебным эффектом;

• разработать проект технических условий на коллагеновые субстанции рыбного происхождения.

Научная новизна проведенных исследований.

Дана гистоморфологическая оценка топографических участков рыбных шкур на примере толстолобика, выявлены особенности локации коллагеновых белков, обосновывающие необходимость контурирования сырья для переработки шкур с получением высокомолекулярного коллагена в виде дисперсий, пористых материалов и пленок. Доказана необходимость применения органических кислот (уксусная, молочная, лимонная, янтарная) при обработке контурированного сырья. Установлено, что для разволокнения коллагеновых фибрилл возможно использование каждой из них для набухания коллагеновых волокон. Методика позволяет получать дисперсию с влажностью 96,3%, содержанием белка 3,12%, в том числе коллагенов 87%, и водородным показателем 5,8. Установлена безопасность коллагеновых субстанций по токсикологическим и микробиологическим показателям Методами термогравометрии (ТГ) и дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), установили температурный предел денатурации 

рыбных коллагенов из толстолобика на уровне 43,13 С°. Показали, что структура коллагена соответствует нативной путем анализа структуры на всех этапах технологической обработки. Обоснован выбор низкотемпературной сушки методом лиофилизации для достижения равномерной пористой структуры. Спектроскопический анализ коллагенов на всех этапах технологического процесса доказывает максимальное сохранение нативной структуры в конечных продуктах, т.е. технология позволяет получать рыбный коллаген в высокомолекулярной форме.

Математические модели для анализа и оптимизации процессов высушивания коллагеновой дисперсии методом лиофилизации имеют практическое значение и позволяют проанализировать свойства готового материала, устанавливать параметры и режимы процессов.

Суммарный отклик ароматических профилей в сенсорных опытах доказывает, что коллагеновые материалы обладают высокими показателями сорбции и дезодорации.

Глава I. Современные знания о структуре и свойствах коллагенов различных соединительных тканей

Соединительная ткань пронизана сетью кровеносных капилляров; она состоит из специальных клеток и сильно развитого межклеточного вещества, которое включает тончайшие нити фибриллярных белков и аморфное основное вещество (рис. 1).

Существенной особенностью соединительной ткани, в основном присущей всем ее разновидностям, является сравнительно небольшое количество клеточных элементов. Среди них выделяют три основных типа: фибробласты и их разновидности, макрофаги и тучные клетки. Остальные клетки (гранулоциты, лимфоциты и плазмоциты) имеют гематогенное происхождение.

Рисунок 1 - Морфология соединительной ткани (схема по

А. И. Слуцкому): I — тучные клетки; II — ретикулиновые волокна;

III — эластическое волокно; IV — коллагеновые волокна;

V — фибробласт

Межклеточные фибриллярные структуры находятся в окружении основного вещества, бесструктурного при набухании. Они представлены коллагеном и эластином, при этом первый образует нити различной толщины. Их расположение определяет функцию, которая главным образом состоит в придании тканям прочности на разрыв; они не растягиваются. На долю коллагена приходится около 1/3 всей массы белков позвоночных. Он преобладает над всеми другими белками, составляя 25—33 % их общего количества, и варьирует в зависимости от вида соединительной ткани (например, в сухожилиях — 25...35 % массы сырой ткани, в костях — 10,0...20,0, в хрящах — 10,0... 15,0, в коже — 15,0...25,0, в стенках сосудов 5,0.. .12,0, в скелетных мышцах — 1,0...2,0, в почках — 0,4... 1,0, в печени 0,1... 1,0, в мозге — 0,2.. .0,4 и т. д.)

В соединительных тканях коллаген находится в сочетании с другими химическими веществами, массовая доля которых зависит от строения, функциональных особенностей и колеблется в пределах (в %): воды — 57,0...63,0; органических веществ — 36,0...42,0, в том числе липидов — 1,0... 1,1, альбуминов и глобулинов — 0,2...0,6, эластина — 1,6...32,0, коллагена — 7,5...32,0; других белков — 0,5... 1,3; экстрактивных веществ — 0,8.. .0,9; неорганических веществ — 0,5.

В зависимости от соотношения основного вещества и разнообразных белковых волоконец, а также химических особенностей составных частей, собственно соединительную ткань разделяют на рыхлую (подкожная клетчатка), плотную (сухожилия), эластическую (шейная связка), слизистую (слюна, желудочный сок, суставная жидкость).

В качестве основного структурного компонента соединительной ткани коллаген играет главную роль в осуществлении ее разнообразных биологических функций: опорной, трофической, защитной, морфогенетической или структурообразовательной. Например, влияет на пролиферацию и дифференциацию хондробластов и остеобластов, эпителия различных желез, легких, почек, роговицы, мышечной ткани при культивировании in vitro; in vivo — влияет на трансформацию мышечной ткани в хрящевую и костную [42]. Структурообразовательная функция реализуется благодаря активному взаимодействию паренхимы с эпителиальными и мышечными клетками во время эмбриогенеза и регенерации, что обеспечивает правильное развитие органов и тканей. При осуществлении регенеративной функции коллаген не только выступает основным пластическим материалом новообразованной соединительной ткани, восстанавливающей все дефекты в организме, но и активно взаимодействует с клетками, ответственными за организацию регенеративного процесса, в частности, является важнейшим фактором агрегации тромбоцитов [42]. Адгезия тромбоцитов к элементам сосудистой стенки служит важнейшим информативным показателем при лабораторной диагностике и оценке эффективности лекарственной терапии широкого перечня гематологических и сердечно-сосудистых заболеваний, включая артериальные тромбозы и атеросклероз [20].

Коллаген обеспечивает структурную и физическую целостность организма, участвует, как указано выше, в барьерной, регенеративной, метаболической, терморегуляторной и ряде других функций различных органов [46].

Значительный вклад в развитие знаний о структуре, свойствах и прикладных возможностях коллагена связан с именами как отечественных (В. Н. Орехович, В. И. Мазуров, Л. В. Антипова, Л. И. Слуцкий, А. А. Зайдес, А. Н. Михайлов, А.И. Сапожникова, И. А. Рогов, Н. Н. Липатов, А. И. Мглинец и др.), так и зарубежных (С. Г. Сотело, К. Кюн, А. Вейс, М. Танзер, С. А. Батечко, А. М. Ледзевиров и др.) ученых.

Основу структурной организации коллагенового волокна составляют ориентированные в продольном и поперечном направлении, сдвинутые на четверть ступенчато расположенные параллельные ряды тропоколлагеновых молекул (рис. 2), что обусловливает поперечную исчерченность фибрилл с периодом от 60 до 70 нм. Варьирование периода обусловлено тем, что коллаген — не индивидуальный белок, а семейство сходных белков с некоторыми структурными отличиями, зависящими от их анатомической функции и вида организма [39, 49, 7, 13].

Рисунок 2 - Тропоколлагеновые молекулы:

а — структура коллагена (по Ричу и Крику); б — различные уровни структурной организации коллагена (по Кону): 1 — третичная структура; 2 — молекула тропоколлагена; 3 — коллагеновое волокно

Установлено [39, 1], что N- и С-концевые участки, не принимая участия в образовании тройной спирали, не имеют регулярного строения и содержат окисленные остатки лизина, которые, взаимодействуя друг с другом, образуют межмолекулярные поперечные сшивки.

Аминокислотный состав и последовательность концевых участков (рис. 3) изучены относительно мало, но им отводится важная роль в самосборке молекул коллагена [1], их межмолекулярном взаимодействии, антигенности и т. д.

Рисунок 3 - Усредненная кристаллическая структура (Pro-Pro-Gly)9 с разрешением 1,0 А, полученная методом рентгеновской дифракции.

Принимая во внимание, что аминокислотная последовательность полипептидной цепи определяет пространственную структуру белков, а пространственная структура — биологическую и технологическую функциональность [33, 52, 2], следует подчеркнуть, что коллаген по сравнению с другими белками обладает специфическим составом и необычной последовательностью аминокислот. Коллагены соединительных тканей представлены волокнами, которые, в свою очередь, состоят из коллагеновых фибрилл, характерных поперечно-исчерченной структурой.

Фибриллы имеют различную ориентацию в зависимости от биологической функции соединительной ткани: в сухожилиях, например, фибриллы коллагена расположены в виде поперечно-связанных параллельных пучков, обладающих большой прочностью на разрыв и практически нерастяжимых. В верхних кожных покровах КРС фибриллы коллагена образуют нерегулярно сплетенную густую сеть. В роговице глаза имеются слои коллагеновых фибрилл, уложенных крест-накрест. При большом увеличении под микроскопом обнаружено, что фибриллы имеют характерную рифленую структуру (рис. 4).

Рисунок 4 - Структура:

а — структура интактных коллагеновых волокон кожи (в соответствии с данными J. Gross, 1961); б — дермального слоя шкуры крупного рогатого скота (КРС); в — становой жилы КРС; г — шкуры карпа

Но вне зависимости от расположения фибрилл коллагена в различных соединительных тканях на электронных микрофотографиях в них всегда обнаруживается характерная регулярно повторяющаяся поперечная исчерченность. Точное значение периода может несколько варьировать, поскольку, как указано выше, коллаген — это семейство белков с отличиями, зависящими от анатомической функции белков и вида организма.

Фибриллы выстраивают нити, имеющие форму цилиндра с диаметром 5...200 нм (в зависимости от вида ткани). Фибриллы коллагеновых нитей состоят из субъединиц, называемых тропоколлагеном, которые, как указано на рис. 1.2, ориентированы в продольном и поперечном направлении.

Молекулы тропоколлагена имеют относительную молекулярную массу около 300 000 Да, толщину ~ 1,5 нм и длину 300 нм. Они состоят из полипептидных цепей двух видов (αl и α2), которые образуют тройную спираль, напоминающую кабель. Состав цепей зависит от типа коллагена (табл. 1.1). Коллаген типа I, наиболее распространенный в организме животных, состоит из двух цепей одного вида, обозначаемых a 1(1), и третьей цепи, обозначаемой α2. Коллагены других типов состоят из трех идентичных цепей [4].

Таблица 1 - Типы коллагена в составе тканей и органов животных

В настоящее время охарактеризовано 19 типов коллагена (табл. 1) и, учитывая наличие разных молекулярных форм в пределах одного типа (например, коллаген типа I имеет состав [αl(I)]2 либо [αl(I)]3), считают, что существует не менее 10 олигомерных форм коллагена. Каждая цепь состоит из 1000 остатков аминокислот и представляет собой левозакрученную спираль, в которой на виток приходится три аминокислотных остатка [6, 11]. Причем размеры и периодичность каждой спирали отличаются от соответствующих параметров α-спирали. Коллагеновая спираль уникальна, так как не встречается ни в каких других белках. Основу структурной организации коллагенового волокна составляют сдвинутые на четверть, ступенчато расположенные параллельные ряды тропоколлагеновых молекул (рис. 5).

Рисунок 5 - Схематическое изображение структурной организации

коллагенового волокна:

— молекулы тропоктшлагена;        — промежутки в рядах между молекулами тропоколлагена

Любопытная структурная особенность волокна состоит в том, что расположенные в ряд молекулы тропоколлагена не связаны «конец в конец». Между концом одной молекулы и началом следующей имеется промежуток около 40 нм, наличие которого играет особую роль при формировании кости, состоящей из органической фазы, практически целиком представленной коллагеном, и неорганической, представленной фосфатом кальция. Установлено, что первые кристаллы откладываются с интервалом порядка 68 нм, что совпадает с периодом коллагенового волокна. В связи с этим, вероятно, что промежутки вдоль ряда молекул тропоколлагена выполняют роль центров отложения минеральных составных частей кости.

Именно эти структурные особенности позволяют объяснить наличие поперечной исчерченности фибрилл с определенной периодичностью. Молекулы тропоколлагена, выделенные во внеклеточное пространство, агрегируют, образуя микрофибриллы и фибриллы; в каждой молекуле тропоколлагена обнаруживаются четыре поперечные полосы, повторяющиеся с интервалом 64 нм (рис. 6).

Рисунок 6 - Расположение молекул тропоколлагена в коллагеновых фибриллах

Зрелый коллаген стабилизирован ковалентными связями и практически нерастворим, что на протяжении многих лет служило препятствием для изучения его химических свойств. Положение изменилось лишь после того, как обнаружилась возможность экстракции растворимого коллагена из тканей молодых животных благодаря относительно малому количеству в нем поперечных связей.

Отсутствие ковалентных поперечных связей в незрелом коллагене и позволило выделить основную структурную единицу, названную тропоколлагеном.

Теперь установлено, что коллаген по сравнению с другими белками обладает специфическим составом и необычной последовательностью аминокислот. Коллагены содержат около 35 % остатков глицина и приблизительно 11 % остатков аланина, что необычно много для большинства известных белков. В гемоглобине, например, содержание глицина составляет 

только 5 % от общей суммы аминокислот.

Еще более характерным отличительным признаком коллагена является высокое содержание пролина и 4-гидроксипролина — аминокислоты, которая, за исключением коллагена и эластина, практически не встречается в белках. В коллагене содержатся две нестандартных аминокислоты — гидроксипролин и гидроксилизин (рис. 7).

Рисунок 7 - Структурные формулы нестандартных аминокислот, входящих в состав коллагена:

а — гидроксилизин; б — гидроксипролин

В сумме на долю пролина и гидроксипролина приходится около 21 % аминокислотных остатков коллагена. Уникальная структура тропоколлагена прекрасно увязана с необычностью аминокислотного состава.

Пирролидиновые кольца, преобладающие в составе аминокислот (пролина, гидроксипролина), имеют особые стереохимические свойства и ограничивают гибкость цепи, вследствие чего образуются изгибы. Поэтому их присутствие в белках несовместимо с существованием α-спиралей. Таким образом, формируется специфическая вторичная структура в виде трехцепочечных спиралей (рис. 8). Компактная трехцепочечная структура возможна также потому, что каждый третий остаток в аминокислотной последовательности цепи тропоколлагена представлен глицином, а-углеродный атом которого погружен внутрь молекулы, где R-группа любой другой аминокислоты разместиться не может. Три цепи стабилизируются водородными связями, которые образуют Н-атомы NH-групп глицина и О-атомы СО-групп первого пролина тройки Gly-Pro-Pro. При этом Gly цепи «1» формирует связь с цепью «2», a Pro — с цепью «3» и т. д. Завиваясь вокруг двух других, каждая цепь коллагена образует правую суперспираль. В масштабе конформаций отдельных остатков коллагеновая цепь образует левую «микроспираль» типа poly(Pro)II, что прослеживается по направлению пролиновых колец [45, 48, 51, 17].

Основу первичной структуры коллагена составляет многократный повтор трех аминокислотных остатков (Gly-Pro-Pro)n, или точнее (GlyX-Pro)n, причем NH-группа Gly каждой тройки принимает участие в образовании водородных связей. Интересно отметить, что экзоны, кодирующие коллагеновую цепь, всегда начинаются с глицина и содержат число кодонов, кратное трем [15].

Рисунок 8-1 ройная спираль тропоколлагена:

а — расположение аминокислот: ● — оксипролин, о — пролин, 

° — глицин; б — схематичная упаковка тропоколлагеновых цепей; 

в — геометрия упаковки тропоколлагена

В тропоколлагене (в отличие от глобулярных белков) R-группы всех аминокислот находятся на внешней стороне молекулы и мало участвуют в стабилизации структуры, хотя и играют роль в межмолекулярном взаимодействии при образовании фибрилл и волокон. В коллагене обнаружены ковалентные связи необычного типа, образующиеся между двумя остатками лизина, находящимися в соседних цепях. Расположенные рядом друг с другом тропоколлагеновые тройные спирали тоже соединены поперечными связями. Именно вследствие очень плотной скрученности тройных спиралей и наличия поперечных связей тропоколлаген практически нерастяжим.

Специфика аминокислотного состава, последовательность расположения по длине полипептидных цепей, реакционная способность функциональных групп обусловливают сложность и особенность пространственной структуры коллагена на всех уровнях. В настоящее время охарактеризовано по меньшей мере пять структурных уровней молекулы коллагена (табл. 2).

Таблица 2 - Уровни пространственной структуры молекулы коллагена

Сложность структуры коллагена определяет важные функциональные свойства этого белка, приспособленные человеком в его практической деятельности при переработке животных тканей:

• способность сохранять структуру на молекулярном уровне при выделении из тканей и отделении от других компонентов;

• способность после выделения и перевода в раствор к реконструкции с образованием различных видов надмолекулярных структур, что широко используется для получения различных видов искусственных коллагеновых материалов (ИКМ), находящих применение в пищевой промышленности, медицине, ветеринарии и других отраслях народного хозяйства;

• возможность стабилизации надмолекулярной структуры и ее дополнительного структурирования, лежащие в основе консервирования, первичной обработки и переработки коллагенсодержащего сырья (выделка кожи и меха), а также получение искусственных или модифицированных коллагеновых мате риалов.

Формирование многоуровневой пространственной структуры коллагена invivo сопряжено с последовательными этапами биосинтеза проколлагена и последующей биомодификации (рис. 9) с образованием зрелой коллагеновой фибриллы [8, 9, 10].

Рисунок 9 - Образование коллагена invivo (GLC означает глюкозу;

GAL — галактозу)

Биосинтез коллагена invivo реализуется поэтапно [52]: шаг 1 — биосинтез про-арцепей и про-аг-цепей (по 1300 остатков в каждой) в пропорции 2:1; шаг 2 — гидроксилирование некоторых остатков Pro и Lys; шаг 3 — присоединение Сахаров (GLC-GAL) к гидроксилированным остаткам; шаг 4 — образование тримера и S-S связей на его концах; шаг 5 — образование тройной спирали в средней части молекулы проколлагена; шаг 6 — секреция проколлагена во внеклеточное пространство; шаг 7 — отщепление концевых фрагментов с глобулярной структурой; шаги 8... 10 — спонтанное образование фибрилл из тройных суперспиралей, окончательная модификация аминокислотных остатков и образование ковалентных сшивок между модифицированными остатками коллагеновых цепей.

Локализация проколлаген-пептидаз вне фибробласта подтверждает факт формирования коллагенового волокна во внеклеточной жидкости вблизи его поверхности. Концевые пептиды в цепях-предшественниках препятствуют несвоевременному формированию волокна, и, вероятно, участвуют в переносе проколлагена через мембрану фибробласта. На внутриклеточном этапе дополнительные пептиды способствуют взаимной ориентации и соединению трех цепей для последующего образования тройной спирали, при этом особое значение имеют межцепочечные дисульфидные связи между С-концевыми пептидами трех цепей в проколлагене [49].

Интересно заметить, что при самоорганизации invitro коллагеновых нитей, лишенных глобулярных концевых фрагментов, формируются тройные спирали, имеющие существенные отличия по сравнению со структурой нативного коллагена, например, неправильный сдвиг нитей относительно друг друга; отсутствие геторогенности, обусловленной наличием нитей двух типов, и т. д.

Поскольку молекулы проколлагена, в отличие от тропоколлагена, не способны к спонтанному образованию волокна, что сопряжено с предварительным отщеплением N- и С-концевых пептидов [49, 14, 16], прослеживается явная аналогия в механизмах биосинтеза проколлагена, фибрина, проферментов поджелудочной железы и других секреторных белков.

Резюмируя известные сведения об особенностях молекулярной структуры коллагена, можно заключить, что стабильность спирали отдельной цепи тропоколлагена зависит от количества остатков пролина и гидроксипролина. Далее тройная спираль стабилизируется поперечными 

водородными связями и ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями между аминокислотными остатками разных цепей. Наличие глицина в каждом третьем положении последовательности аминокислот служит статическим разрешением для существования суперспирали.

Анализ источников научно-технической литературы за период 1997...2019 гг. свидетельствует о весьма интенсивном накоплении и углублении теоретических знаний о механизмах структурообразования фибриллярных белков, энергетических параметрах их архитектоники, термодинамических характеристиках фазовых переходов и т. д. с целью последующего применения в исследовательской практике и отраслях народного хозяйства.

Глава II. Экспериментально-аналитические исследования свойств сырья для получения молекулярного коллагена

2.1 Краткая характеристика методов проведения исследований

Общий химический состав сырья рыбного происхождения, содержащего коллагеновый белок и его продуктов в виде гидрата коллагена, губок, определяли указанными ниже методами.

Массовая доля влаги [36] - проводили в соответствии с требованиями ГОСТ 9793.

Количество белка [29]- методом Къельдаля по ГОСТ 31795.

Массовая доля сухих веществ [19] - по ГОСТ 31795.

Массовая доля золы [30] - по ГОСТ 31795.

Содержание коллагена [29]- по ГОСТ 31795 в шкурах прудовых рыб и губчатых коллагеновых материалов, количественно определяли по методу Воловинской.

Водородный показатель (рН) [37] измерения производили на рН-метре в соответствии с ГОСТ 28972 на приборе Edge HI 2002-02.

Коэффициент желатинизации [30] проводили по ГОСТ 22181.

Вязкость [19] определяли на вискозиметре вибрационном SV-10.

Микробиологические показатели [31]определяли в соответствии с указаниями.

Общее количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов - по ГОСТ ISO 21149, Candida albicans - пo ГОСТ ISO 18416; Escherichia coli - пo ГОСТ ISO 21150; Staphylococcus aureus - по ГОСТ ISO 22718; Pseudomonasa eruginosa - по ГОСТ ISO 22717.

Санитарно-гигиенические исследования [31] включали в себя общие показатели токсикологического и кожно- раздражающего действия:

• Мышьяк определяли по ГОСТ 26930;

• Ртуть - по ГОСТ 26927; Свинец - по ГОСТ 30178;

• Кожно-раздражающее действие - по Инструкции 1.1.11-1 35;

• Воздействие на слизистые оболочки (однократно) – по Инструкция 1.1.11-1 35;

• Общетоксическое действие, определяемое альтернативными методами in vitro - по №29ФЦ/394 от 29.01.2002.

Определение степени набухаемости гидрата коллагена и материалов на его основе [30] - по ГОСТ 24160. Степень набухания выражается в процентах. По степени набухания определяли способность коллагена поглощать воду в растворах органических пищевых кислот.

Степень набухания, % рассчитывали по формуле:

    Х= m2 · 100%/m1   (1) 

где m2 - масса навески после набухания, г;

m1 - исходная масса навески, г

Органолептические показатели готового продукта

Определение качества готового продукта проводили по органолептическим показателям, устанавливая соответствие основных показателей, таких как внешний вид, цвет, запах, консистенция требованиям ГОСТ 7631.

Определение влагосодержания коллагенового материала

Около 1,0 г (точная навеска) исследуемого вещества высушивают в сушильном шкафу при температуре 100-105° до постоянной массы.

Расчет влагосодержания проводят по формуле

(2)

где Х-содержание влаги в материале, %; 

(а-b) - потеря в массе, г;

с - навеска.

Определение общей пористости [30] проводили по ГОСТ 24468. По результатам определения истиной и кажущейся плотности вычисляли общую пористость.

Кажущуюся плотность, г/см , вычисляли по формуле:

(3)

где mсух- масса сухого образца, 

V - объем образца, см. 

Объем образца, см, вычисляли по формуле:

      (4)

где - линейные размеры образца, см.

Общую пористость Побщ, %, вычисляли по формуле:

   (5)

где ρ - плотность материала образца, г/см3, определяемая в соответствии с требованиями ГОСТ 2211.

Микроскопическое исследование пористых материалов проводили на приборе «Растровый электронный микроскоп JSM-6510LV JEOL с системой микроанализа Bruker XFlash 5010». Получали изображения морфологии поверхности проводящих и непроводящих материалов с нанометровым разрешением. Проводили исследование губчатых материалов с определением толщины покрытия и слоем пленарных образцов с разрешением х5 – х300 000 (в пересчете на площадь фотопластины 120 мм*90 мм).

Микроскопические исследования коллагенового продукта [41] Исследования проводили на обычном лабораторном микроскопе без иммерсии. Конденсор микроскопа был опущен, диафрагма сужена.

Эксперимент проводили на первом этапе при малом увеличении (х40), затем увеличение доводили до (x100), (х400) и более. Для объективных значений данных исследовали несколько образцов материалов для исключения ложноположительных результатов. Процесс получения изображений и их анализ состоял из ввода изображения с объектива при макросъемке (установленной на микроскопе при съемке микроскопических объектов) на компьютер и использования соответствующего программного обеспечения.

Исследования форм связи влаги в исследуемых объектах [43, 44] Для исследования закономерностей теплового воздействия на свойства шкур рыбы и гидрата коллагена был использован метод неизотермического анализа и прибор синхронного термического анализа модели «STA 449 F3 Jupiter» (рисунок 10). Измерения проводились в алюминиевых тиглях в среде газообразного азота класса 5,0.

Рисунок 10 - Прибор синхронного термического анализа STA 449 F3

Для получения и обработки информации использовали программы «NETZSCH Proteus» и «Microsoft Excel». На первом этапе эксперимента осуществляли нагрев тиглей с образцами до 298 К, со скоростью нагрева 0,5 К/минуту, производили выдержку при 298К на протяжении 20 минут. Далее нагревали до 573 К и поддерживали нагревание со скоростью 10 К/мин. Масса навески для шкуры рыб -4,680 мг, гидрата коллагена —27,7787 мг.

Полученные результаты рассчитывали по методу неизотермической кинетики с нахождением степени превращения а.

      (6)

Спектры поглощения в УФ и видимом диапазоне гидрата коллагена, при 25 C°, 48 С° [40] измеряли с помощью экспериментальной установки, созданной на базе волоконного спектрометра USB4000-UV-VISES (Ocean Optics). В спектрометре USB4000-UV-VIS устанавливали детектор DET4-200-850c фильтром высших порядков дифракции для работы в диапазоне длин волн 200-850 нм. Входная щель шириной 25 мкм обеспечивала оптическое разрешение — 1.5 нм (FWHM), позволяющее исследовать оптические свойства биопроб на основе спектров. Определяли концентрацию вещества в растворе с помощью метода спектрофотометрии.

Определение структурных особенностей коллагенового продукта на всех этапах обработки методом инфракрасной спектроскопии [32] проводили на многофункциональном спектрометре Фурье МРА, разработанном для оптимизации работы, решения широкого спектра задач. Данный метод позволяет проводить исследования жидких образцов в диапазоне 12 800 — 3 600 см-1, порошковых образцов на ИК-спектро-фотометре Specord M-80 (Германия) и Vertex-70 в диапазоне 4000-400 см-1.

На первом этапе эксперимента в камере поддерживали температуру 37 °С, затем измельчали образцы около 3-5 минут, извлекали навеску 1,5 мг образца и 9,5 мг КВr, перемешивали, извлекали 2 мг, полученную массу образца запрессовывали в пресс-форме, в процессе вращения пуансона получали ровную поверхность. Затем смесь прессовали (при давлении 150 кг/см3) на протяжении 10 минут. В результате получалась таблетка диаметром 3 мм, помещали в держатели спектрофотометра. Рекомендуется во время проведения эксперимента поддерживать влажность не выше 70 %.

Исследовались области 4000 - 2500 см-1, для которых характерны колебания О-Н-, N-H- и С-Н-связей (рис. 11).

Рисунок 11 - Инфракрасный спектр органического вещества

Определение суммарных ароматов [34, 38] проводили на приборе «МАГ-8» в соответствии с методом «электронный нос» (рисунок 12 в режиме подачи пробы «Front-linemovement» (фронтальная подача запаха в околосенсорное пространство в замкнутом пространстве) и инжекторного ввода равновесной газовой фазы над образцами.

На первом этапе готовили образцы из серии проб 4 шт., герметично упаковывали, затем добавляли газовую среду с молекулами летучих соединений, и пропускали через полиуретановую мембрану, отбирали газовую смесь. Отобранный образец инжектировали в ячейку детектирования.

Анализировали отклики сенсоров в течение 3 минут и регистрировали в компьютере частоту откликов. Продолжительность времени анализа составил около одного часа (рисунок 12).

Рисунок 12 - Схема «электронного носа»

Гистоморфологические исследования различных участков шкур толстолобика проводили в соответствии с ГОСТ Р 50372.

На сегодняшний день, одним из наиболее объективных и современный видов микроскопической техники считается конфокальная микроскопия. Данный вид исследований часто применяют в области клеточной биологии, что позволяет изучить морфологию и строение клеток, что обеспечивается высочайшим разрешением и контрастностью. С помощью этого метода возможно определять такие органоиды как ядро, аппарат Гольджи, цитоскелет, и даже наличие и вид хромосом, а также наличие в них отдельных генов. Отражая в памяти компьютера ряд оптических срезов, можно сконструировать трехмерную модель исследуемого объекта.

Главный метод исследования в гистологии — микроскопирование. Основными объектами исследования являлись гистологические препараты и их изображения. Изготовление гистологических препаратов для изучения с помощью светового и электронного микроскопов складывалось из следующих этапов:

1. взятие кусочка материала и его фиксация (например, в формалине, в
   спирте) для закрепления структур в прижизненном состоянии;

2. уплотнение материала путем заливки в парафин, смолы, целлоидин — для придания кусочку однородной плотности;

3. изготовление срезов;

4. окрашивание срезов для контрастирования различных структур;

5. заключение срезов в особые среды для длительного их хранения.

Оценка молекулярно-массового распределения белковых фракций образцов

Анализ фракций проводили с помощью электрофореза в 8 % полиакриламидном геле. В качестве маркеров использовали стандартный набор белков AppliChem (ProductNo.A4402). Электрофорез проводили в денатурирующих условиях.

Буферы для электрофореза:

анодный буфер для белкового SDS - электрофореза (10х): 30mМ Tris-НС1 (рН 8,45); 1,92М глицин; 1 % SDS;

катодный буфер для белкового SDS - электрофореза (10х): 30mМ Tris-НС1 (рН 8.45), 1.92М глицин;

буфер для концентрирующего геля: 4% акриламид (акриламид: бисакриламид - 29:1); 0.13М Tris-HCl (рН 6.8); 2% SDS; 0,004% персульфат аммония; 0,003% TEMED;

буфер для разделяющего геля: 10% акриламид (29:1 акриламид: бисакриламид); 0,375М Tris-HCl (рН 8.7); 2% SDS; 0.004% персульфат аммония; 0.003% TEMED.

Фракцию растворимых белков анализировали с помощью SDS-электрофореза в 8% ПААГ. Образцы наносили по 5 мкл в каждую лунку. В качестве маркера использовали коммерческий набор полипептидов. Во время миграции образцов в концентрирующем геле (—10% от общего объема геля) напряжение поддерживали на уровне 100В. При перемещении фронта в разделяющий гель напряжение повышали до 140В. Электрофорез проводили до выхода бромфенолового синего из геля. Гели окрашивали 0,25% раствором Кумасси синего R250 (Sigma, USA) в смеси вода: этанол: уксусная кислота (6:4:1).

Идентификация коллагенов на основании электронно- микроскопического анализа - атомно-силовая микроскопия.

Оценку морфологических отличий коллагеновых дисперсий различно происхождения проводили методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Этот метод используется для определения рельефа поверхности с разрешением от десятков ангстрем вплоть до атомарного. Принцип работы атомно-силового микроскопа основан на регистрации силового взаимодействия между поверхностью исследуемого образца и зондом. В качестве зонда используется наноразмерное остриё, располагающееся на конце упругой консоли, называемой кантилевером. Сила, действующая на зонд со стороны поверхности, приводит к изгибу консоли. Появление возвышенностей или впадин под остриём приводит к изменению силы, действующей на зонд, а значит, и изменению величины изгиба кантилевера. Таким образом, регистрируя величину изгиба, можно сделать вывод о рельефе поверхности.

При работе в полуконтактном режиме также возбуждаются колебания кантилевера. В нижнем полупериоде колебаний кантилевер касается поверхности образца. Такой метод является промежуточным между полным контактом и полным бесконтактом.

Достоинства метода:

- Наиболее универсальный из методов АСМ, позволяющий на большинстве исследуемых образцов получать разрешение 1 -5 нм;

- Латеральные силы, действующие на зонд со стороны поверхности, устранены - упрощает интерпретацию получаемых изображений;

Недостатки метода:

- Максимальная скорость сканирования меньше, чем в контактном режиме.

Для калибровки атомно-силового микроскопа Интегра-Вита (NT-MDT, Россия) были использованы плазмидар Gem длиной 8896 н.п., ДНК фага А, (Progema, Россия) длиной 48502 п.о. так как изучаемые препараты скорее всего содержат именно коллаген, который является фибриллярным белком. Препараты в буфере, содержащем 0,5 М уксусную кислоту, наносили на свежеприготовленный скол слюды и проводили абсорбцию в течение 5 минут, затем промывали дистиллятом и высушивали в течение 30 минут.

(7)

     (8)

Оценка молекулярно-массового распределения белковых фракций образцов

Анализ фракций проводили с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле. В качестве маркеров использовали стандартный набор белков AppliChem (ProductNo.A4402). Электрофорез проводили в денатурирующих условиях.

Буферы для электрофореза:

анодный буфер для белкового SDS - электрофореза (10х): 30mМ Tris-НС1 (рН 8,45); 1,92М глицин; 1% SDS;

катодный буфер для белкового SDS - электрофореза (10х): 30mМ Tris-НС1 (рН 8.45), 1.92М глицин;

буфер для концентрирующего геля: 4% акриламид (акриламид: бисакриламид - 29:1); 0.13М Tris-HCl (рН 6.8); 2% SDS; 0,004% персульфат аммония; 0,003% TEMED;

буфер для разделяющего геля: 10% акриламид (29:1 акриламид: бисакриламид); 0,375М Tris-HCl (рН 8.7); 2% SDS; 0.004% персульфат аммония; 0.003% TEMED.

Фракцию растворимых белков анализировали с помощью SDS-электрофореза в 8% ПААГ. Образцы наносили по 5 мкл в каждую лунку. В качестве маркера использовали коммерческий набор полипептидов. Во время миграции образцов в концентрирующем геле (~10% от общего объема геля) напряжение поддерживали на уровне 100В. При перемещении фронта в разделяющий гель напряжение повышали до 140В. Электрофорез проводили до выхода бромфенолового синего из геля. Гели окрашивали 0,25% раствором Кумасси синего R250 (Sigma, USA) в смеси вода: этанол: уксусная кислота.

Идентификация коллагенов на основании электронно- микроскопического анализа - атомно-силовая микроскопия.

Оценку морфологических отличий коллагеновых дисперсий различно происхождения проводили методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Этот метод используется для определения рельефа поверхности с разрешением от десятков ангстрем вплоть до атомарного. Принцип работы атомно-силового микроскопа основан на регистрации силового взаимодействия между поверхностью исследуемого образца и зондом. В качестве зонда используется наноразмерное остриё, располагающееся на конце упругой консоли, называемой кантилевером. Сила, действующая на зонд со стороны поверхности, приводит к изгибу консоли. Появление возвышенностей или впадин под остриём приводит к изменению силы, действующей на зонд, а значит, и изменению величины изгиба кантилевера. Таким образом, регистрируя величину изгиба, можно сделать вывод о рельефе поверхности.

При работе в полуконтактном режиме также возбуждаются колебания кантилевера. В нижнем полупериоде колебаний кантилевер касается поверхности образца. Такой метод является промежуточным между полным контактом и полным бесконтактом.

Достоинства метода:

- Наиболее универсальный из методов АСМ, позволяющий на большинстве исследуемых образцов получать разрешение 1-5 нм;

- Латеральные силы, действующие на зонд со стороны поверхности, устранены - упрощает интерпретацию получаемых изображений;

Недостатки метода:

- Максимальная скорость сканирования меньше, чем в контактном режиме.

Для калибровки атомно-силового микроскопа Интегра-Вита (NT-MDT, Россия) были использованы плазмидар Gет длиной 8896 н.п., ДНК фага А, (Progema, Россия) длиной 48502 п.о. так как изучаемые препараты скорее всего содержат именно коллаген, который является фибриллярным белком. Препараты в буфере, содержащем 0,5 М янтарную кислоту, наносили на свежеприготовленный скол слюды и проводили абсорбцию в течение 5 минут, затем промывали дистиллятом и высушивали в течение 30 минут.

Глава III. Химическая и гистоморфологическая характеристика шкур различных видов рыб

3.1 Сравнительная оценка химических характеристик шкур различных видов рыб

Для оценки потенциальных возможностей шкур пресноводных и морских рыб в получении коллагеновых субстанций, уточняли факторы химического состава, а именно:

• общее содержание белка;

• фракционный состав белков;

• содержание оксипролина (как фактор, отражающий концентрацию целевого вещества - коллагена);

• содержание жира и жирных кислот (как балластные вещества, препятствующие процессам целенаправленного выделения коллагена и перевода его в растворимое состояние).

В качестве образцов были взяты шкуры без чешуи пресноводных: (сазан, толстолобик, щука) и морских рыб (семга, горбуша, сельдь).

Рисунок 13 — Содержание общего белка в шкурах рыб

Данные по содержанию общего белка представлены на рисунке 13.

Массовая доля белка варьирует от 14,16 для сельди до 25,67 г/100  шкуры у сазана. Данные об общем содержании белковых веществ в шкурах использовали с целью определения фракционного состава белков на основе их растворимости для оценки количественного содержания целевой щелочерастворимой (коллагенсодержащей) фракции.

Рисунок 14 - Фракционное распределение белков в шкурах рыб

На диаграмме (рис.14) видно, что в качестве превалирующего компонента представлены щелочерастворимые белки, максимальное содержание которых отмечается в шкуре толстолобика, наименьшее - в шкуре сельди.

Ввиду того, что целевым веществом в сырье является коллаген, то представляло интерес определить содержание аминокислоты оксипролина, которая является структурным признаком коллагенов. Наибольшее содержание оксипролина, а следовательно, и коллагена отмечено в шкурах сазана и толстолобика (таблица 3).

Сравнительные данные содержания оксипролина представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Содержание оксипролина в образцах шкур

Такая градация основана прежде всего на максимальном содержании щелочерастворимой фракции и окспипролина и минимальном содержании жировой.

3.2 Исследование гистоморфологических особенностей топографических участков шкур прудовых рыб

На протяжении долгих лет разрабатывались методы и способы очистки от нежелательных примесей продуктов из коллагена [28, 35]. В основном все методы с применением агрессивных сред или же включают применение ферментных препаратов. В соответствии с поставленной задачей необходимо совершенствовать технологию гидрата коллагена, за прототип принимали патент РФ № RU 2614273, как наиболее близкий по технологической сущности. Для достижения более высоких органолептических и физико-химических показателей готового гидрата, проводили сравнительные экспериментальные исследования. В задачу данного этапа исследований входило установление необходимых условий сушки губчатых коллагеновых основ с высокой влагоемкостью.

Образцы коллагеновых дисперсий по прототипу имели неоднородную структуру, ярко выраженную зернистость и включали остатки сгустков плотной структуры соединительной ткани. Это связано, по нашему мнению, с агрессивной средой на заключительной стадии обработки сырья, включающей добавление 6 % уксусной кислоты, что влечет избыточную агрегацию или деструкцию волокон коллагена (рисунок 15). Исследования производили с использованием лабораторного микроскопа без иммерсии. Исследуемый образец помещали на предметное стекло при малом увеличении (x40), последующие исследования проводили с возрастающим увеличением до х400 и более. Исследовали несколько образцов материала для надежности и достоверности, исключения ложноположительных результатов (рис. 15).

Рисунок 15 - Увеличенный образец коллагенового продукта, выделенного по патенту патент РФ № RU 2 614 273: 1, 2 - сгустки соединительной ткани, 3, 4 - постороние включения

Как видно на рисунке 15, коллагеновая субстанция не удовлетворяет предъявляемым требованиям, что подтверждает актуальность создания усовершенствованной технологии. При увеличении гидромодуля не решается проблема вязкости, сильного запаха (выраженный рыбно-уксусный) и высокой кислотности среды, ограничивающей применения низкотемпературной сушки. Результаты исследований рН приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Показатели рН гидрата коллагена.

Для получения коллагеновых белков с сохранением исходного строения фибрилл нужно выделить коллагеновую субстанцию с высокими показателями вязкости, минимальным содержанием воды, а также с нейтральным водородным показателем. Для этого необходимо усовершенствование предварительной обработки шкур путем уточнения требований к исходному сырью. На рисунке 16 видно, что в местах крепления плавников и брюшной части, гистологическая характеристика шкуры значительно отличается по плотности. Это подтверждено детализированным, гистоморфологическими исследованиями топографических участков шкур.

Рисунок 16 - Строение плавников рыбы

Уплотненная структура шкуры в области плавников рыбы связана с двигательной активностью и обеспечением более высоких показателей прочности, чем в остальных участках шкуры. Таким образом, для получения монолитной структуры дисперсии требуется дифференциация сырья, связанная с предварительным изучением этих участков перед обработкой шкур в технологическом источнике.

Рисунок 17- Участки шкуры толстолобика, необходимые для дальнейших исследований

Многие годы ученые изучали кожные покровы рыб, однако преимущественно все исследования направлены на физиологические различия внутри и между видами рыб. Необходимо обратить пристальное внимание на кожное строение. В нашем случае наибольший интерес представляют более глубокие дермальные слои, в которых локализуются коллагеновые белки.

Строение шкуры рыб кардинально отличается от строения млекопитающих как характеристиками прочности, так и строением дермы. У рыб преимущественно эпидермис представлен тремя слоями, заканчивающимися подкожной клетчаткой. Сам эпидермис весьма тонкий, состоит из 2-3 слоев клеток, преобладают колбовидные и железистые клетки, выделяющие секрет-слизь. Связь дермы с верхним слоем слабая. Основное отличие от млекопитающих - отсутствие рогового слоя, у рыб эпидермис состоит из живых клеток по всему объему. У млекопитающих верхний слой представлен омертвевшими клетками, которые и формируют ороговевший слой [25, 26].

Рыбы обитают в среде, которая не подвержена резким перепадам температур, но при этом адаптируются к условиям внешней среды, не имея нагрузки на опорный скелет. Формирование тканей кожных покровов сопровождается рядом функций, таких как наличие железистых клеток эпидермиса. Обильное выделение слизи не свойственно для всех представителей семейства гидробионтов. В дерме находятся железистые клетки это влияет на строение волокон коллагена, они получаются зернистыми, сложенными из гидрофильных мукополисахаридов и углеводно-белковых комплексов (муцинов, мукоидов).

При взаимодействии с водой зерна проявляют способность к обильному набуханию и образовывают структурированный густой гель на поверхности дермы. В более глубоких слоях видно образование переплетений волокон соединительной ткани фибриллярных белков двух видов: коллагеновых (преобладающих) и эластиновых. В основе дермы преобладают трехспиральные слои волокон. Они расположены параллельно друг другу, скреплены перпендикулярно расположенными волокнами. В структурах дермы эластиновое волокно присутствует в меньших количествах. Скорее всего, это связанно с условиями обитания пресноводных рыб и отсутствием у шкур рыб высоких прочностных характеристик, в отличии от млекопитающих. У млекопитающих строение фибрилл слабо ориентировано трехмерной сеткой. У рыб образуется строгая ориентация волокон коллагена в трех взаимно перпендикулярных направлениях. Подкожная клетчатка у рыб развита куда меньше, нежели у млекопитающих, из-за отсутствия необходимости в терморегуляции кожных покровов.

При совершенствовании подготовки сырья для получения коллагеновой основы проводили исследования шкур толстолобика. Были взяты образцы шкуры рыб, образцы которых фиксировали в 10% растворе формалина. Заливка образцов осуществлялась по модификации Ремейса. Вместо бензол-парафина использовали толуол-парафин с целью ускорения растворения. Отмывку от парафина проводили толуолом. Подготовленные образцы заливали в полистирол.

С целью выявления элементов соединительной ткани, в том числе и эластиновыхволокон, срезы окрашивали по Ван-Гизону. Микроструктуру шкуры толстолобика изучали с помощью светового микроскопа.

Внешние покровы костных рыб, к которым относится и толстолобик, представлены тремя слоями, достаточно хорошо видимыми в световой микроскоп.

Верхний слой шкуры толстолобика относительно тонкий. При окраске по Малори окрашивается в синий цвет, представлен крупными клетками, формирующими эпидермис. Слизь на поверхности эпидермиса окрашивается в темно-синий цвет (область 1) (рис.18).

Рисунок 18 - Микроструктура кожи толстолобика (увеличение х400).

Эпидермис отделен от слоя, расположенного ниже, пограничной пластинкой (область 5, 6). Слой под пограничной пластинкой составляет основу шкуры (кориум, дерма), характеризующуюся ярко выраженной волокнистой структурой (область 3, 4).

Эпидермис представлен многослойным эпителием, состоит из ряда призматических клеток (вытянутых по высоте), постепенно замещающимися на более плоские (область 1) (рис.19). Наружный верхний слой состоит из плоских клеток. Средний слой эпидермиса представлен несколькими рядами клеток, по мере приближения к поверхности кожи изменяющих свою форму от призматической до плоской (область 2) (рис.19).

Между клетками эпидермиса располагаются железистые клетки трех основных типов: бокаловидные (кубковидные), серозные (зернистые) и колбовидные. Эти клетки выделяют слизь на поверхность кожи (область 1, 3).

На границе эпидермиса и основы шкуры отдельными группами располагаются пигментные клетки, атак е кровеносные сосуды (область 2, 4) (рис. 19).

Рисунок 19 - Микроструктура кожи толстолобика. Пигментные включения на границе эпидермиса и дермы (увеличение х400)

Под эпидермисом располагается основа шкуры, которая представлена достаточно толстым слоем. Дерма представлена двумя слоями: наружным рыхлым и внутренним плотным. В наружном слое располагаются чешуя, в более глубоком - нервные окончания и кровеносные сосуды.

Дерма представляет собой плотную волокнистую соединительную ткань. В отличии от млекопитающих, у которых волокнистые структуры в основе шкуры коллагеновые и эластиновые, но расположены не упорядоченно, у толстолобика волокна коллагена располагаются упорядоченно (рис. 19, 20). Это связано с тем, что коллагеновые волокна участвуют в фиксации чешуи и формируют трехмерную структуру. Между пучками коллагеновых волокон I и II порядка расположены прослойки рыхлой соединительной ткани (область 1) (рис. 20).

Рисунок 20 - Микроструктура кожи толстолобика. Коллагеновые

фибриллы (увеличение х600)

Под слоем дермы располагается слой подкожной клетчатки, клетки которой способны накапливать жир и формировать липоциты, из которых далее жировую ткань. Анализируя микроструктуру шкуры толстолобика, стоит обратить внимание, что основа шкуры (дерма) составляет наиболее развитый слой шкуры, отличающийся наличием густой упорядоченной расположенной сетью коллагеновых и эластических волокон (область 2 ) (рис. 20), сосредоточенных в средних участках шкуры. В приплавниковой, прижаберной зоне шкуры сосредоточенны слои подкожной клетчатки, что доказывает целесообразность использования шкуры рыб для получения коллагеновых субстанций.

3.3 Исследование структурных изменений дермального слоя шкур на стадиях технологической обработки методом ИК-спектроскопии

Весьма важным моментом является сохранение нативной структуры коллагена (высокомолекулярная форма) для чего потребовалось проведение дополнительных исследований, связанных с предварительной обработкой шкур.

Были отобраны образцы исходной шкуры толстолобика и проведено сравнительное исследование структуры образцов на каждой стадии технологического процесса методом ИК-спектроскопии.

Рисунок 21 - ИК-спектроскопия получения гидрата коллагена.

1. — исходный образец (шкура толстолобика);

2. — кожа после обработки NaOH - пероксид водорода;

3. — кожа после обработки пищевой янтарной кислотой;

4. — конечный продукт — коллаген рыбного происхождения.

Отбирались пробы на каждой стадии обработки шкур массой 10 гр. затем образцы помещались в спектрометр.

На первом спектре колебаний при исследовании исходной шкуры толстолобика наблюдается от 3500 см-1 разноупорядоченные метил и метальные группы -CO-NH-, что характерно для общей структуры белковых молекул. В исходном образце отмечен пик 1570 -1515 см-1 NH амид II и колебания C-N),так и пик 1638 см-1 - характерный для вторичных аминов.

На второй стадии обработки (после обработки пероксидом и щелочью) эти группы исчезли. Это связано скорей всего с взаимодействиями белков с пероксидом водорода. Амид III наблюдается на пике 1245 см-1, пики 1378,1245 амид II .Это говорит о том, что на участках амидных связей происходит обрыв цепей и они могут взаимодействовать с водой.

Следующие 5 пиков увеличиваются до 1790 см-1. Это соответствует С=О карбоксильным группам, которые могут взаимодействовать с аминами. По всей видимости происходит превращение карбоксильных групп после взаимодействия с NaOH, число этих групп увеличивается. Просматриваются валентные колебания С2 О, в области 1250 -1230. Это колебания = С — О —, и СН группы при 1067 = С — О могут проявляться оксимителиновые и оксипролиновые группы. Потом этот пик исчезает, и количество групп уменьшается. На третьей стадии обработки при воздействии янтарной кислоты наблюдаются амиды (1, 11). Аминные группы накладываются на водородные связи соединенных цепей. Это характерно для коллагеновых фибрилл. На последнем этапе при взаимодействии с водой водородные связи диспергируют, и возможно влияние СО2. Есть взаимодействие вода-вода в области меньше 3400 см-1. Это не нарушает строения воды в области поглощения более 3500 см-1, это водородные связи в воде связанные двойными и тройными связями. Амиды IV-V в конце исчезают, что обуславливает высокое взаимодействии с водой. Во время оценки структуры белковых молекул, наиболее важно участие ОН-групп в образовании Н-связей, поскольку гидроксильные группы в структурной связи воды с белковыми молекулами участвуют в стабилизации надмолекулярной и молекулярной организации белка. Водородные связи ОН-группы, наблюдаются в области 3400-3500 см-1. На последней стадии обработки повсеместно прослеживается связь вода-вода. В результате обработки на всех стадиях получения гидрата сохраняются неизменными полосы амид I, амид II, амид III, амид А, характерно присутствие повсеместно полипептидных связей белковых молекул. Полученные результаты свидетельствуют о сохранении нативной структуры коллагенов.

Выводы по I этапу:

1. На основании проведенного химического анализа целевых показателей по степени предпочтения для получения коллагеновых субстанций из шкуры рыб их можно расположить в убывающий ряд: толстолобик – сазан – горбуша – семга – сельдь. 

2. Гистоморфологическая оценка рыбного шкуросырья выявила отличия в структуре дермального слоя: толщина коллагеновых пучков в шкуре пресноводных рыб (сазан, толстолобик) имеют меньшую толщину по сравнению с горбушей и семгой.

3. Учитывая содержание целевого вещества (коллагена) в шкуре, считаем целесообразным для получения коллагеновых субстанций использовать шкуры толстолобика или сазана.

Глава IV. Разработка параметров и режимов технологических процессов получения коллагеновых материалов и средств при алиментарной коррекции физиологических состояний организма и создания медицинских средств для оздоровления. Наработка лабораторных образцов.

4.1 Исследование электрофоретической подвижности коллагеновых белков

Анализ фракций проводили с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле. В качестве маркеров использовали стандартный набор белков AppliChem (ProductNo.A4402). Электрофорез проводили в денатурирующих условиях.

Образцы наносились по 5 мкл в каждую лунку. В качестве маркера использовали коммерческий набор полипептидов. Во время миграции образцов в концентрирующем геле (—10% от общего объема геля) напряжение поддерживали на уровне 100В. При перемещении фронта в разделяющий гель напряжение повышали до 140В. Электрофорез проводили до выхода бромфенолового синего из геля. Гели окрашивали 0,25% раствором Кумасси синего R250 (Sigma, USA) в смеси вода: этанол: уксусная кислота (6:4:1) (рис. 22).

Как видно на рис. 22 фракционный состав коллагеновых дисперсий рыбного и животного происхождения, имеют отличия. Так, для животных коллагенов характерна миграция фракций в области свыше 212 кДа. Имеются фракции, мигрирующие в области соответствующей диапазону 66-212 кДа, что может быть связано с наличием минорных компонентов и сопутствующих белков. Однако количество их значительно меньше. Это свидетельствует о том, что даже в условиях денатурирующего электрофореза основную массу препарата составляет высокомолекулярные белки, для которых не характерна субъединичная структура. 

Для препарата рыбного происхождения также наблюдается миграция мономеров в высокомолекулярной области, выше 212 кДа, однако количество этих фракций значительно меньше. Основная часть коллагена, полученная из рыбных шкур, мигрирует в области 212 кДа. Также присутствует большое количество фракций, мигрирующих в области от 45 до 212 кДа.

Как видно на рис. 22, белки коллагеновых субстанции представляют собой многокомпонентные системы с различной подвижностью фракций под действием электрического поля.

Рисунок 22 - Электрофоретическое фракционирование образцов, содержащих коллаген. Дорожки 1, 4, 7, 10 - маркеры молекулярной массы; дорожки 2, 5, 8 дорожки — образец, полученный из кожи рыб; дорожки 3, 6, 9 — образец, полученный из спилка шкуры КРС.

Согласно данным коллаген имеет молекулярную массу около 300 кДа, по данным С.А. Батечко и A.M. Ледзевирова коллаген, полученный польскими учеными из шкур рыб имеет значения 357-362 кДа, для цепочек α2 значение около 130 кДа, для αl - 105кДа, а для β – 250 кДа и являются доминирующими единицами. В целом следует отметить сходимость полученной информации с данными польских и украинских авторов и доказывает третичную структуру коллагена.

4.2 Электронно-микроскопический анализ коллагеновых дисперсий

В связи с выявленными отличиями электрофоретической подвижности фракций препаратов, полученных из спилка шкур КРС и шкур рыб, представляло интерес оценить морфологические отличия этих образцов. Для этого использовали метод атомно-силовой микроскопии (АСМ).

Препараты в буфере, содержащем 0,5 М уксусную кислоту, наносили на свежеприготовленный скол слюды и проводили абсорбцию в течение 5 минут, затем промывали дистиллятом и высушивали в течение 30 минут. Сканы, полученные в полуконтактном режиме, выявили ряд морфологических отличий в препаратах (рис. 23).

[А]

Рисунок 23 - Визуализация образцов с помощью АСМ. [А] Сканы препаратов, полученный из спилка шкуры КРС. 1 - Скан 50x50 нм; 2 - Скан 4x6 нм; 3 - сечение, проведенное поперек молекулы. [В] Сканы препаратов, полученных из шкуры рыб. 1 - Скан препарата 1,8х1,8 нм; 2-4 - Сечение, проведенное через молекулярные конгломераты; 5 - Скан препарата 2x2 нм; 6-7 - Сечение, проведенное через молекулярные конгломераты; 8 - Скан препарата 3,5х3,5 нм; 9 - Сечение, проведенное вдоль наименьшей молекулы. 

Изучение морфологии препарата животного происхождения соответствует общим классическим представлениям о структуре коллагенов. А именно, ширина молекулы составляет 1-2 нм, а длина фибриллы более 300 нм, при этом, как правило, отдельные молекулы закручиваются в общий жгут. Анализ морфологии препарата, полученного из шкуры рыб, имеет ряд отличий. А именно: ширина частиц, обнаруженных в поле, составляет 4-5 нм, однако их морфология не гомогенна и, скорее всего, состоит из нескольких субъединиц. Однако длина этих частиц относительно одинаковая и составляет около 200 нм, что согласуется с данными, полученными в условиях денатурирующего электрофореза. Таким образом, можно сделать вывод о том, что величина молекул, формирующих фракции препарата рыбного происхождения, имеет значительно меньшие размеры и, вероятно, более низкие уровни организации пространственной структуры.

Есть экспериментальные доказательства ряда авторов, что рыбные коллагены представлены тропоколлагеном, имеющим три структурных уровня.

Полученные нами данные подтверждают эту версию и дополнительно указывают на возможно большие возможности в косметической промышленности и медицине из-за природных особенностей, которые реализованы для более современных косметических и медицинских средств при отменном эффекте - стимулировании собственных биосинтетических механизмов организма человека, а не маскирование имеющихся дефектов.

Таким образом, особенности аминокислотного состава, данные электрофоретического исследования и атомно-силовой микроскопии свидетельствуют об имеющихся отличиях в структуре, а, следовательно, и свойствах коллагенов наземных животных и рыб.

4.3 Сравнительная оценка суммарных ароматов коллагеновых дисперсий различного происхождения

Рыба, а, следовательно, и продукты её переработки имеют сильный, специфический запах, обусловленный наличием триметиламина, его окиси или соединений. Также на формирование «рыбного» запаха оказывают влияние липиды. Ненасыщенные липиды при хранении рыбы окисляются в гидроперекиси, которые являются предшественниками компонентов с прогорклым запахом. Носителями запаха и вкуса продуктов окисления липидов являются альдегиды, кетоны и метилкетоны с небольшой молекулярной массой, а также свободные жирные кислоты с короткой цепью. Для некоторых рыб причиной запаха может являться наличие легколетучих соединений, содержащих серу. В связи с этим представляло интерес провести оценку суммарных ароматов коллагеновой дисперсии рыбного происхождения и сравнить с субстанцией животного происхождения.

Для установления содержания легколетучих соединений в равновесной газовой фазе (РГФ) над образцами коллагеновых субстанций, различного происхождения, сравнивали величины откликов всех выбранных сенсоров в массиве (табл. 14).

Таблица 14 - Отклики сенсоров (Гц) и площадь «визуальных отпечатков» сигналов сенсоров в РГФ над пробами

Установлено существенное различие содержания легколетучих органических соединений, на которые настроен массив сенсоров в равновесной газовой фазе над пробами. При «слепой» органолептической оценке запаха такие пробы воспринимаются дегустаторами как совершенно различные.

Установлено по откликам отдельных сенсоров, что в равновесной газовой фазе над образцами содержатся в основном гидрофильные соединения (полярные легколетучие) и вода, в то же время заметна концентрация азотсодержащих соединений и кислот, сложных эфиров. Интенсивность (суммарная концентрация легколетучих соединений, детектируемая сенсорами) различается в 3,6 раза, между пробами животного и рыбного происхождения.

Для установления различий в составе (качественном и количественном) легколетучей фракции запаха проследили изменение общего содержания легколетучих компонентов в РГФ над пробами. По форме фигуры «визуального отпечатка» максимальных откликов всех сенсоров в массиве и особенно кинетических «визуальных отпечатков» установлена высокая степень их идентичности, что характеризует близкий химический состав проб.

Проследили изменения в количественном составе РГФ над пробой по относительному содержанию основных классов легколетучих соединений, оцененное методом нормировки (табл. 15).

Таблица 15 - Относительное содержание компонентов в пробах, ω % масс.

* - отмечены значимые отличия содержания определенных классов соединений относительно стандарта.

Установлено, что по содержанию основных классов органических соединений образцы идентичны друг другу. Существенно отличается концентрация их в пробах. Различия в качественном составе: В коллагеновой дисперсии рыбного происхождения на 9,2 % меньше спиртов, альдегидов, кетонов, на 8,6 % специфических и серосодержащих соединений, чем в коллагеновой дисперсии животного происхождения. Незначительно больше короткоцепочечных кислот и на 6 % алкиламинов.

Изменения в качественном составе РГФ над пробами проследили с помощью параметра Аi/j, который показывает постоянство соотношения концентраций отдельных классов легколетучих соединений в РГФ (табл. 15).

По соотношению А абсолютных сигналов сенсоров с пленкой ПДЭГС (азотсодержащие органические соединения, вода) и с универсальной пленкой ПВП (ПДЭГС/ПВП) оценивали долю азотсодержащих соединений среди других полярных соединений и воды. Аналогично оценивали долю кислот (Tw с 18К6/ПВП), спиртов, кетонов (ПЭГ2000/ПВП), других соединений, по которым установлены некоторые особенности изменения состава анализируемых проб (табл. 15). Если показатели А для проб близки или совпадают для таких показателей РГФ над пробами по соотношению сигналов сенсоров, то можно считать, что соотношение содержания в пробах указанных соединений одинаково. Если соотношение сигналов отличается от таковых для проб, то соотношение концентраций этих групп соединений различно (табл. 16).

Рисунок 24 - «Визуальные отпечатки» максимальных сигналов и кинетические сигналы сенсоров в РГФ над пробами 

По осям указаны номера сенсоров в матрице. По вертикали — максимальные отклики сенсоров (Гц). По осям указаны номера сенсоров в матрице. По вертикали - максимальные отклики сенсоров (Гц).

Таблица 16 - Соотношение сигналов нескольких сенсоров в матрице для тестируемых проб

* отмечен параметр с максимальным отклонением от стандарта (контроля).

Установлено, что составы равновесных газовых фаз над пробами близки между собой, однако интенсивность запаха (концентрация этих соединений) над образцом рыбного происхождения на 72 % больше, чем над образцом животного происхождения. Такой результат можно объяснить высокой сорбционной емкостью рыбных коллагенов, что обусловлено наличием большого количества функциональных групп, а именно свободных карбоксильных и аминогрупп, что в свою очередь связано с различиями количественного аминокислотного состава.

Определение аминокислотного состава

В ходе экспериментальных исследований проведен сравнительный анализ коллагеновых белков животного и рыбного происхождения по некоторым характерным показателям.

Первичная структура белков представлена набором свободных аминокислот, соединенных пептидной связью. Специфическая последовательность и состав аминокислот определяют особенности структурных уровней пространственного строения, а, следовательно, функции белков, в нашем случае коллагенов. Сравнительный состав аминокислот первичной структуры представлен в таблице 24.

Таблица 24 - Сравнительная характеристика аминокислотного состава коллагеновых субстанций

Как видно из данных таблицы 24, коллагеновые субстанции различного происхождения имеют одинаковый набор аминокислот, но характеризуются разным содержанием отдельных аминокислот, что предполагает различия в структуре, а, следовательно, в свойствах.

Наибольшее отклонение отмечено в количестве аланина, оксипролина. Низкомолекулярные аминокислоты создают условия для более компактных спиралей полипептидных цепей.

Характерной особенностью коллагеновых белков является наличие и высокое содержание таких аминокислот, как пролин и оксипролин. Из таблицы 24 видно, что наибольшие значения имеют именно эти аминокислоты, это доказывает, что полученные дисперсии содержит коллагеновые белки. Именно эти аминокислоты обеспечивают формирование специфической вторичной структуры в виде трехцепочечных спиралей.

Отсутствие триптофана и не высокое содержание серосодержащей аминокислоты — метионина, так же свидетельствует о наличии коллагеновых белков.

Существует мнение, что такие аминокислоты как глицин, аланин, глутаминовая кислота, пролин, серии, аспарагиновая кислота, тирозин могут принимать участие в синтезе коллагена. Большее содержание этих аминокислот наблюдается в случае дисперсии рыбного происхождения, что может говорить о его большей эффективности.

4.4 Технические и токсикологические исследования пористых медицинских материалов

Изучение острой токсичности коллагеновой субстанции

Токсикометрическую оценку коллагеновой субстанции проводили в остром опыте на лабораторных животных (белые крысы, белые мыши). В опыт были взяты по 25 голов белых мышей с массой тела 18-20 г и белых крыс с массой тела 180-200 г. формировали в группы по принципу парных аналогов. За животными вели наблюдение, учитывали клинические симптомы интоксикации. В течение 14 дней после затравки учитывали количество павших и выживших животных. Измельченную коллагеновую субстанцию в виде водной взвеси вводили внутрижелудочно через зонд в различных дозировках с интервалом между дозами 1500 мг/кг живой массы начиная с 500 мг/кг. Внутрижелудочно были введены следующие дозы: 500, 2000, 3500, 5000, 6500, 8000, 9500 мг/кг. Мышам вводили внутрижелудочно, начиная с 500 мг/кг с интервалом между дозами 1000 мг/кг. Были введены следующие дозы: 500, 1500, 2500, 3500, 4500, 5500 мг/кг.

Вначале у грызунов после введения, независимо от дозы, наблюдали легкое угнетение, заторможенность в движениях, взъерошенность шерстного покрова, цианоз слизистых оболочек. Эти признаки через 30-50 минут после затравки нами не регистрировались.

С учетом этого, согласно общепринятой классификации химических веществ (Медведь Л.И., 1964 г.) коллагеновая субстанция является безопасной и относится к 4 классу по токсичности.

Аллергенное и кожно-резорбтивное действие коллагеновой субстанции

При испытании острой токсичности не выявлено признаков раздражающего действия, однако, для подтверждения безопасности применения коллагеновой субстанции провели дополнительные исследования.

Аллергенные свойства коллагеновой субстанции изучали на кроликах методом конъюнктивальных проб и на морских свинках путем накожных аппликаций.

Трем кроликам под верхнее веко правого глаза вносили по одной капле 0; 25; 50 % водной взвеси измельченной коллагеновой субстанции. Для контроля в левый глаз этим же животным вносили по одной капле физраствора. Учет проводили через 5 минут, 24 и 48 часов. При этом оценивали состояние слизистой оболочки глаза и век, наличие инъекции сосудов, секрецию слезы. Сразу после инстилляции у животных опытной группы наблюдалась небольшая реакция в виде инъекции сосудов и повышенной секреции, которые исчезали через 30 мин.

Провокационные кожные пробы проводили на морских свинках методом аппликаций. Перед началом аппликаций проводили сенсибилизацию животных путем многократного нанесения на кожу коллагеновой субстанции. Ежедневно на выстриженный участок кожи трем морским свинкам накладывали коллагеновые субстанции. На 14 день (время инкубационного периода) на свежевыстриженный участок кожи наносили разрешающие дозы.

В течение всего периода опыта за морскими свинками вели наблюдение, проводили измерение температуры тела, толщины кожной складки на месте аппликации, определяли температуру на месте введения. Изменений в клиническом статусе животных и на месте аппликаций коллагеновой субстанции не выявлено. На основании этого ответную реакцию оценивали отрицательно.

Эмбриотоксическое и тератогенное действие

Эмбриотоксическое действие коллагеновой субстанции изучали на беременных белых крысах с массой тела 180-200 г. В опыт были взяты 40 голов, из которых 20 голов беременных белых крыс в период имплантации (5 день беременности) и 20 голов в период органогенеза (17 день беременности). 10 животным из каждой группы вводили однократно в желудок водную взвесь коллагеновую субстанцию 5000 мг/кг живой массы, оставшиеся по 10 голов из каждой группы служили контролем. На 20 день провели убой животных по 5 голов из каждой группы и учитывали раннюю и позднюю резорбцию плода, общую плодовитость, количество желтых тел беременности, живых и мертвых эмбрионов. В результате не было выявлено различий между животными опытных и контрольных групп.

От оставшихся 25 самок было получено потомство, за развитием которого вели наблюдение: проводили взвешивание, замеры длины тела, хвоста, ступней, ушей, учитывали сроки отлипания ушей, прорезания глаз, обрастание шерстным покровом, подвижность и активность высасывания молока матери в течение первых дней жизни.

Изучали влияние на постнатальное развитие. В этой серии экспериментов опытные крысы получали субстанцию с 1 по 21 день беременности в дозе 5000 мг/кг ежедневно. Вторая группа служила контролем.

За 1-2 дня до родов самок рассаживали по одной в клетке. Регистрировали день родов и число крысят в помете. Новорожденных крысят распределяли по 7-8 на самку, для более равномерного вскармливания. О полноценности вскармливания судили визуально, по наполнению желудка крысят молоком: до появления шерсти он хорошо виден через брюшную стенку. В 30-ти дневном возрасте отделяли от матери и рассаживали самцов и самок отдельно.

О постнатальном развитии потомства судили по массе, показателям физического развития, а также по некоторым поведенческим реакциям крысят. Животных взвешивали один раз в неделю, начиная с однонедельного и до 2,5-месячного возраста. На основании полученных данных вычисляли константу роста, характеризующую прирост массы за единицу времени. Показателями общего развития явились: время открытия ушей, глаз, обрастания шерстью. В определенные возрастные периоды исследовали поведенческие реакции животных с помощью описанных ниже методов.

Один раз в неделю определяли спонтанную двигательную активность крысят. С этой целью был использован актометр, предложенный Раевским К. С. и Тимофеевым В. А. (2000 г.). Принцип измерения двигательной активности основан на определении числа переходов животного в клетке с одной пластины на другую. Эти горизонтальные перемещения регистрируются автоматически.

На 5, 10, 15 и 20 день жизни изучали ориентировочную реакцию по методике "залезания на сетку" (КшегКлер, 1999). Время наблюдения - 2 минуты. Кроме этого, на 10 день жизни, когда глаза крысят еще закрыты, определяли способность животных удерживаться в сетке в течение двух минут.

На течение и продолжительность беременности субстанция не оказывала влияния. Так, у контрольных и опытных крыс беременность продолжалась 22-23 дня, у самок, которые получали субстанцию - 23 дня. Была отмечена разница в численности помета крысят и дальнейшем их развитии. Проводилось сравнение развития крысят опытной и контрольной групп.

Физическое развитие. Масса крысят, матери которых получали состав, не отличалась от массы контрольных животных на протяжении всего периода изучения.

У крысят подопытных и контрольных животных не наблюдалось различий и по другим показателям общего развития - и у тех, и у других крысят уши отлипались на 2-3 день жизни, с 8 дня крысята начинали обрастать шерстью, между 1 6 и 1 9 днем у них открывались глаза.

Методика открытого поля. По данной методике изучали поведение животных "в открытом поле". В таблице 25 представлены результаты опытов.

Таблица 25 - Поведение крысят «в открытом поле»

Установлено, что двигательная активность крысят, матери которых получали коллагеновую субстанцию практически не отличалась от двигательной активности контрольных.

По выраженности исследовательского рефлекса, за проявление которого принимали количества заглядываний животных "в отверстия поля", опытные крысята не отличались от контрольных.

Спонтанная двигательная активность. Двигательная активность крысят, мамы которых получали во время беременности состав и крысят контрольной группы не отличались.

Тест "залезания на сетку". Ориентировочную активность потомства изучали по тесту "залезания на сетку". Простая регистрация, объективность оценки и несложная аппаратура способствовали широкому применению этой методики. "Залезание на сетку" - сложная реакция животного. Это попытка к бегству, стремление к познаванию окружающей обстановки, проявление чувства страха и любопытства. Kniep (1999) обозначает эту реакцию как "симптом волнения". Это врожденный образ поведения, он проявляется без предварительной тренировки,

Проведенные эксперименты показали, что потомство, родившиеся у крыс, получавших при беременности коллагеновую субстанцию не отличалось от контрольного увеличенной ориентировочной активностью. На 20 день жизни число крысят, мамы которых во время беременности получали препарат, и контрольных животных, поднявшихся по сетке, было одинаковым.

Таблица 26 - Ориентировочная активность крысят, матери которые получали коллагеновую субстанцию во время беременности

Таблица 27 - Ориентировочная активность крысят, матери которых получали коллагеновую субстанцию во время беременности

Таким образом, коллагеновая субстанция не влияет на постнатальное развитие крысят.

Влияние на центральную нервную систему. О влиянии на центральную нервную систему судили по изменению ориентировочных реакций: вертикального компонента, исследовательского рефлекса и числа обследованных отверстий (тест Буасье-Симона), а также по изменению порога болевого раздражения.

Изменение ориентировочных рефлексов у животных опытной группы не носило статистически значимого характера.

Порог болевого раздражения (зажатие хвоста) у животных обеих групп был одинаков.

Таблица 28 - Влияние коллагеновой субстанции на ориентировочные рефлексы крыс

Таким образом, месячное скармливание коллагеновой субстанции не оказало влияние на функциональное состояние центральной нервной системы.

Достоверных различий между крысятами опытных и контрольных групп в постэмбриональном развитии не выявлено.

Тератогенное действие коллагеновой субстанции изучали на белых крысах. После спаривания самкам через день в течение всей беременности вводили максимально возможную дозу по объему для введения в желудок — 5000 мг/кг, и получили от них потомство. У новорожденных крысят изменений, классифицируемых как уродства, не было выявлено.

Изучение подострой токсичности

Целью изучения подострой токсичности является выявление избирательного влияния вещества, на функциональное состояние отдельных органов, тканей и систем, а также его способность к кумуляции.

Кумулятивные свойства изучали в эксперименте на белых крысах, которым скармливали в течение 45 дней коллагеновую субстанцию в дозах: 1-ой группе - 500 мг/кг массы тела; 2-ой группе - 5000 мг/кг массы тела; 3-ей группе субстанцию не скармливали, она служила контролем. Все животные содержались на едином рационе.

В течение всего опыта за подопытными животными вели наблюдение, учитывали поедаемость корма, прием воды, состояние слизистых оболочек, 

волосяного покрова, поведение, взвешивали в начале и в конце эксперимента.

В результате у грызунов не зарегистрировали гибели, не отмечали признаков интоксикации и заболеваний. Динамика прироста массы тела представлена на рисунке 25.

Рисунок 25 - Прирост массы тела крыс при применении коллагеновой субстанции в течение 45 дней, граммов

Таким образом, применение коллагеновой субстанции в течение 45 дней не снижало прироста массы тела опытных животных, а наоборот способствовало увеличению данного показателя на 63,48 % в 1-й группе и на 1,6 во 2-й группе по сравнению с контролем.

Морфологические показатели крови - количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина и гематокрит у животных всех групп существенно не отличались и находились в пределах нормы (таблица 30).

Углеводная, белково-образовательная и мочевинообразовательная функции печени не нарушены.

Таблица 30 - Морфологические показатели крови и костной ткани белых крыс

Изучение хронической токсичности коллагеновой субстанции

Исходными данными для исследования хронического действия субстанции служат результаты острого и подострого опытов. Целью хронического эксперимента является выявление отдаленных последствий применения химических веществ на животных и человека.

Изучение отдаленных последствий влияния коллагеновой субстанции проводили на белых крысах в течение 6 месяцев. Ее скармливали ежедневно в дозе 500 мг/кг и 5000 мг/кг массы тела, 3 группа грызунов была контрольной. В период эксперимента за животными вели наблюдение, проводили учет поедаемости корма и приема воды, ежемесячно взвешивали.

В результате у животных не выявили ухудшения поедаемости корма и приема воды, клинических признаков интоксикации. Отмечено увеличение прироста массы тела.

Биохимическими исследованиями установлена тенденция увеличения количества эритроцитов, гемоглобина, общего белка, хотя эти показатели во всех группах находились в пределах нормы колебания.

Для изучения влияния препарата коллагеновой субстанции на воспроизводительную функцию после 6 месяцев скармливания коллагеновой субстанции самки и самцы были спарены по следующим вариантам:

• самки и самцы, получавшие субстанцию в дозе 2,5 т/кг;

• самки и самцы, получавшие субстанцию в дозе 5,0 г/кг;

• самки, получавшие коллагеновую субстанцию в дозе 2,5 г/кг с самцами, не получавшими препарат;

• самцы, получавшие субстанцию в дозе 2,5 г/кг с самками контрольной группы;

• самки, получавшие субстанцию в дозе 5,0 г/кг с самцами контрольной группы;

- самцы, получавшие субстанцию в дозе 5,0 г/кг живой массы с самками, не получавшими препарат;

- самки и самцы, не получавшие коллагеновую субстанцию.

Существенных различий в количестве приплода между опытным и контрольными животными не выявлено. В среднем плодовитость составила 9-10 особей на одну самку. У новорожденного потомства не зарегистрировано признаков, классифицируемых как уродства.

В первый день после рождения проводили взвешивание и промеры длины тела, хвоста крысят.

По живой массе, длине тела и хвоста новорожденные крысята мало отличаются и находятся в пределах нормы колебания. В дальнейшем у крысят учитывали сроки отлипания ушей, прорезания глаз, обрастание шерстным покровом и активность высасывания молока матери. По этим и другим признакам существенных различий у пометов по всем вариантам спаривания не выявлено.

В результате изучения хронической токсичности отрицательно отдаленных последствий не выявлено, в том числе признаков канцерогенности.

На основании вышеизложенного можно заключить, что проведенными токсикологическими исследованиями не установлено отрицательного влияния коллагеновой субстанции на организм экспериментальных животных, не выявлены противопоказания к проведению дальнейших исследований и использованию.

Гистологические исследования

1 сутки после начала лечения. Во всех группах кожа вокруг ран отечная и гиперемированная, пальпация в проекции раны вызывает беспокойство животного. Отмечается серозно-геморрагическое отделяемое. В группах, где использовались коллагеновые губки и коллагеновая субстанция из рыбного сырья (2-я контрольная и 1-я основная группы) отмечалось визуально менее выраженная воспалительная реакция (уменьшение отека и гиперемии).

В 1-й контрольной группе на 1-е сутки после нанесения раны выявлялась гистологическая картина травматического воспаления: повреждение эпидермиса, кровоизлияния, некротические массы, инфильтрация значительным количеством нейтрофильных лейкоцитов (рис. 1). Мышечные волокна раздвинуты вследствие межмышечного отека. Соединительная ткань воспалена. Отек тканей возрастает в паравуальных тканях и сопровождается сдавлением капилляров и венул, препятствующего оттоку крови. Наблюдается повышенная проницаемость сосудистой стенки с выходом в ткани форменных элементов и белковых составляющих крови. В 1-й контрольной группе наиболее интенсивная базофилия при выявлении РНК наблюдалась в пределах базального и шиповатого слоев, что косвенно указывает на наиболее активные метаболические процессы на данном уровне. Продукт реакции (РНК) откладывается в клетках эпидермиса в виде дисперсной базофилии в цитоплазме, встречаются клетки с более крупными гранулами. Средняя оптическая плотность РНК в клетках базального и шиповатого слоев составила 0,25±0,01 усл. ед. Наибольшее количество сульфгидрильных групп отмечается в поверхностных слоях эпидермиса. SH-группы расположены в основном в виде мелкозернистой массы. Средний уровень оптической плотности SH-групп в клетках базального и шиповатого слоев составил 0,25±0,01 усл. ед.

Рисунок 26 - Выраженная лейкоцитарная инфильтрация в зоне раневого дефекта. 1 контрольная группа. 1 сут. Окраска гематоксилином и эозином.

Увеличение х280

Во 2-й контрольной группе на 1 сутки дефект эпидермиса густо инфильтрирован полиморфноядерными лейкоцитами, лимфоцитами, плазмоцитами и макрофагами. Выражены полнокровие, отек и набухание коллагеновых волокон. Мышечные волокна раздвинуты в следствие отека, некоторые с выраженной дистрофией и явлениями миолиза. В межмышечных пространствах воспалительная инфильтрация представлена преимущественно полиморфноядерными лейкоцитами.

На 1 сутки в 1-й основной группе в области дефекта наблюдается воспалительная реакция, умеренный некроз и отек мягких тканей с лейкоцитарной инфильтрацией (рис. 27). При выявлении РНК определяется умеренная цитоплазматическая базофилия с более выраженной реакцией в пределах базального и шиповатого слоев, где среднее значение оптической плотности составило 0,28±0,01 усл. ед. Средняя оптическая плотность SH-групп составила 0,31±0,01 усл. ед.

Рисунок 27 - Воспалительная реакция в области раны. 1 основная группа. 1 сут. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х280

В 1 контрольной группе площадь ран через сутки от начала эксперимента составила в среднем 18,5±0,5 мм2, во 2-й контрольной группе -12,8±0,6 мм2, в 1-й основной группе - 12,6±0,6 мм2 (табл. 31). Соответственно, уменьшение площади ран в 1 контрольной группе составило 29,2%, в 1 контрольной группе - 50,8%, 1 основной - 51,7%.

Таблица 31 - Динамика изменения площади ран животных, мм

1 - достоверность различий по сравнению с исходными данными; 

2 - достоверность различий по сравнению с данными 1-й контрольной группы.

3 сутки после начала лечения. Поведение подопытных животных практически не отличалось от поведения здоровых. Гиперемия купировалась в 1-й контрольной группе на 1,8±0,5 сутки, во 2-й контрольной - на 1,3±0,5 сутки, в 1 основной группе - на 1,3±0,4 сутки. Скудное серозное отделяемое отмечалось только в 1-й контрольной группе. В группе животных, не получавших лечения отек купировался в среднем на 2,2±0,3 сутки, применение стандартной коллагеновой губки - способствовало снижению изучаемого показателя на 1,7±0,4 сутки, коллагеновой субстанции из рыбного сырья — на 1,6±0,3 суток. Уменьшение отделяемого до скудного наблюдалось в 1-й контрольной группе на 2,7±0,4 сутки, во 2 контрольной -на 1,7±0,4 сутки, в 1 основной - на 1,7±0,4 сутки (табл. 32).

Таблица 32 - Клинические признаки течения раневого процесса, сутки

*-достоверность различий по сравнению с 1-контрольной группой р<0,05

В 1 контрольной группе площадь ран на 3-й сутки от начала эксперимента составила в среднем 9,2±0,4 мм2, во 2-й контрольной - 5,7±0,3 мм2, в 1-й основной - 5,8±0,3 мм2. Т.е. уменьшение площади ран составило в среднем за сутки в 1 контрольной группе 21,6%, во 2 контрольной - 26,0%, в 1 основной - 25,9%.

Таким образом, ко 2-м суткам во 2-й контрольной и 1-й основной группах, и к 3-м суткам после начала лечения в 1-й основной группе отмечалось полное купирование признаков воспаления с заживлением ран под полоской струпа. Можно констатировать, что признаки воспаления или первая фаза раневого процесса купировалась в 1-й основной группе в среднем на 34-65% быстрей по сравнению с 1-й контрольной группой.

На 3-й сутки после моделирования раневого процесса в 1-й контрольной группе наблюдается умеренная воспалительная и отечная реакции окружающих тканей, менее выраженные по сравнению с первыми сутками. В воспалительном инфильтрате присутствуют клеточные компоненты: лейкоциты с распадающимися ядрами, единичные тканевые базофилы, макрофаги и лимфоциты; по периферии инфильтрата - мышечные волокна имеют протяженные участки некроза, видны единичные фибробласты; в области дна раны - единичные очаги грануляционной ткани. Отмечается выпадение фибрина, который связан со стенками раневого дефекта. В сетчатом слое дермы наблюдается единичное количество коллагеновых волокон. На 3-й сутки в 1-й контрольной группе интенсивность окраски эпителиальных клеток при выявлении РНК усиливается, особенно в глубоких слоях эпидермиса, где наблюдается равномерное отложение базофильного материала или его локализация в перинуклеарной зоне. Оптическая плотность РНК в среднем составила 0,25±0,01 усл. ед. (рис. 28) Средняя оптическая плотность SH-групп в клетках базального и шиповатого слоев составила 0,26±0,01 усл. ед. и была равномерной в слоях эпидермиса.

Рисунок 28 - Отложение продуктов реакции при выявлении РНК в пределах эпидермиса. 1 контрольная группа. 3 сут. Окраска Азуром В. Увеличение х280

Во 2-й контрольной группе на 3-е сутки наблюдается умеренная воспалительная и отечная реакция в паравуальной зоне, на поверхности формируется грануляционная ткань и сосудисто-капиллярная сеть: организованный фибрин, фибробласты, гистиоциты и эндотелиоциты, видны небольшие скопления полиморфноядерных лейкоцитов. На 3-й сутки во 2-й контрольной группе среднее значение оптической плотности составило 0,27±0,01 усл. ед. для РНК и 0,27±0,01 усл. ед. для SH-гpyпп.

На 3-е сутки в 1-й основной группе дефект эпидермиса уменьшен, края раны отечные. Наблюдается восстановление целостности кожи, что проявляется утолщением краевого эпидермиса в результате активации репаративной регенерации (рис. 29).

Рисунок 29 - Утолщение краевого эпидермиса указывает на потенцирование

восстановительных процессов. 1 основная группа. 3 сут. Окраска

гематоксилином и эозином. Увеличение х280

Отмечается расхождение мышечных волокон за счет воспалительной инфильтрации, заполняющей межмышечные пространства, формирование молодых грануляций, по периферии раны - пролиферативная реакция эпидермиса и элементов кожи. Коллагеновые волокна инфильтрированы макрофагами, фибробластами и эозинофильными лейкоцитами. Выраженная реакция в эндотелии сосудов при выявлении ЩФ в данной экспериментальной группе свидетельствует об активных процессах ангиогенеза, что указывает на стимулирование формирования грануляционной ткани. На 3-й сутки среднее значение оптической плотности РНК- 0,29±0,01 усл. ед., активных SH-rpynn - 0,29±0,01 усл. ед. (рис. 30).

Рисунок 30 - Выраженная реакция при выявлении РНК в пределах эпидермиса. 1 основная группа. 3 сут. Окраска Азуром В. Увеличение х280

Анализ токсичности действующего вещества к началу 7 суток исследования показал, что острого состояния в исследовании не обнаружено. Отклонения частоты дыхательных движений и сердечных сокращений находились в пределах нормы вне зависимости от группы исследования. Температура тела варьировала в пределах ±0,7 - 0,8°С также вне зависимости от группы исследования. Неврологическо-поведенческий статус не изменялся. Суммарный тест «Открытое поле» составлял 52,4 с, а «Подвисание» - 11,2 с. Качественный анализ иммуноглобулина Е показал отсутствие сенсибилизационного эффекта на 7 сутки исследования.

7 сутки после начала лечения. В 1 контрольной группе площадь ран на 7-е сутки от начала эксперимента составила в среднем - 4,5±0,4 мм2, во 2-й контрольной группе - до 1,5±0,3 мм2, в 1-й основной группе - до 1,5±0,3 мм2.

Скорость уменьшения площади ран за сутки в 1 контрольной группе в среднем составила 11,8%, во 2 контрольной и 1 основной группах — по 13,5%.

На 7-е сутки в 1-й контрольной группе воспалительная реакция менее выражена, сохраняется инфильтрация клетками воспаления. Поверхность раны заполнена грануляционной тканью, выявляются микроабсцессы различной локализации. В зоне формирования рубца видно повышенное количество фибробластов, извитые с преимущественным горизонтальным направлением коллагеновые волокна, формирующиеся мелкие капилляры. Наблюдается увеличение среднего значения оптической плотности РНК в пределах базального и шиповатого слоев до 0,31±0,01 усл. ед. Количество сульфгидрильных групп в эпидермисе в пределах базального и шиповатого слоев увеличивается, достигая 0,30±0,01 усл. ед.

На 7-е сутки во 2-й контрольной группе наблюдаются минимальные признаки воспалительной реакции, в некоторых ранах еще присутствуют лейкоциты, выраженные коллагено- и ангиогенез. Поверхность раны покрыта эпидермисом с подлежащей грануляционной тканью, богатой полнокровными сосудами и капиллярами, с большим количеством эозинофилов, фибробластов, гистиоцитов и тканевых базофилов, значительное количество коллагеновых волокон (рис. 31). По периферии имеются тучные клетки. В глубине раны, в межмышечных пространствах происходит формирование мелких капилляров. На 7-е сутки среднее значение оптической плотности РНК составляет 0,30±0,01 усл. ед., SH-гpyпп (преимущественно в поверхностных слоях) - 0,29±0,01 усл. ед.

Рисунок 31 - Формирование коллагеновых волокон в области дна раны в окружении выраженного клеточного компонента. 2 контрольная группа. 7 сут. Окраска по Ван-Гизону. Увеличение х120

На 7-е сутки после моделирования ран мягких тканей в 1-й основной группе наблюдается восстановление тканей в зоне раневого дефекта, в дерме - сформированные коллагеновые волокна и грануляционная ткань (рис. 32).

Рисунок 32 - Сформированные коллагеновые волокна в области дна раны. 1 основная группа. 7 сут. Окраска по Ван-Гизону. Увеличение х120

На 7-е сутки при выполнении гистологического исследования отмечается эпидермизированная рана с подлежащей грануляционной тканью, покрытая корочкой (рис. 33).

Рисунок 33 - Восстановление целостности кожного покрова. 1 основная группа. 7 сут. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х120

11 сутки после начала лечения. 11 суткам во всех группах клинически наблюдался полностью сформировавшийся рубец, сформировавшаяся грануляционная ткань, которая полностью закрывает раневой дефект. Обращает внимание отсутствие достоверных различий между группами с использованием коллагеновых губок и коллагеновой субстанции из рыбного сырья. На 11-е сутки в 1-й контрольной группе в области эпидермиса при выявлении РНК определяется выраженная базофилия на уровне глубоких слоев, уровень РНК составляет 0,30±0,01 усл. ед., оптическая плотность SH-групп - 0,29±0,01усл. ед.

К 11-м суткам во 2-й контрольной группе образовался сформированный эпителизированный рубец (рис. 72). Среднее значение оптической плотности РНК в клетках базального и шиповатого слоев составило 0,30±0,01 усл. ед., SH-гpyпп - 0,28±0,01 усл. ед. На 11 сутки в 1 основной группе раневой дефект полностью закрыт, в дерме - сформированные коллагеновые волокна. Среднее значение оптической плотности РНК - 0,31±0,01 усл. ед., сульфгидрильных групп - 0,30±0,01 усл. ед. (рис. 34).

Рисунок 34 - Сформированный эпидермис в зоне регенерата. 2 контрольная группа. 11 сут. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х280

Рисунок 35 - Зона регенерата с преимущественно горизонтальным расположением волокон. 1 основная группа. 11 сут. Окраска по Ван-Гизону.

Увеличение х120

Рисунок 36 - Выявление РНК в клетках эпидермиса. 1 основная группа. 11 сут. Окраска Азуром В. Увеличение х 120

При сравнении морфологии ран отмечается более выраженная положительная динамика заживления ран во 2-й контрольной и 1-й основной группах, что проявилось в более быстром снижении отечности тканей, организации фибрина и формирования коллагена. Установлено, что коллагеновый материал, накладываемый на поверхность раны способствовал местному гемостатическому действию.

При проведении сравнения с группой животных, не получавших дополнительного лечения, были получены убедительные данные, свидетельствующие об ускорении репаративных процессов в мягких тканях под воздействием стандартной коллагеновой губки и коллагеновой субстанции из рыбного сырья, особенно выраженное в первой фазе раневого процесса, что проявлялось в стимуляции ангиогенеза, коллагеногенеза, активации метаболических процессов, сопровождающихся повышением уровня реакций при выявлении РНК, ЩФ. Проведенные экспериментальные исследования не выявили токсического и аллергического действий коллагеновой субстанции из рыбного сырья как при анализе клинических данных, так и при изучении результатов гистологического и гистохимического исследований.

4.5 Использование коллагеновых материалов рыбного происхождения в косметологии

Исходя из данных, полученных в результате компаративного исследования средств для волос и средств для кожи без содержания коллагена, с содержанием коммерческого коллагена и с содержанием коллагенового геля, следует, что средства с содержанием коллагенового геля проявляют свойства на уровне коммерческого аналога.

Показатели, полученные аппаратными методами исследования (кореометрия, себуметрия, спектрофотометрия, микрометрия, визуальное изучение структуры с помощью камеры х100 увеличением, измерение статического электричества) после использования средств для волос с лабораторным коллагеновым гелем находятся в пределах нормы. По субъективным оценкам пробантов действие средств с коллагеновым гелем сравнимо с действием коммерческого аналога. Согласно мнению респондентов, средства с коллагеновым гелем проявляют достаточно высокую смываемость, не вызывают эффекта утяжеления и жирности волос.

Исследование потребительских свойств средств для кожи с глицерином, с коммерческим коллагеном, а также с лабораторным коллагеновым гелем, показало, что крем с коллагеновым гелем продемонстрировал результаты на уровне коммерческого аналога, а в рамках субъективной оценки состояния кожи до и после использования — превзошел коммерческий аналог.

Анализ действия «чистого» коллагенового геля Proficoll® позволяет сказать, что после использования в течение двух недель, уровень увлажненности кожи рук увеличился на 21% (степень увлажненности увеличилась у 9 из 10 пробантов), а степень покраснения и шелушения кожных покровов снизилась в среднем 5% у большей части пробантов. В ходе исследования средств для кожи были использованы такие методы, как корнеометрия, себуметрия, мексаметрия, десквамация, а также метод прямых оценок.

1. Сорбционные свойства и оценка детоксицирующего эффекта коллагеновых белков

Пути попадания в организм человека токсичных веществ представлены на рис.37.

Рисунок 37 - Пути попадания в организм человека токсичных веществ 

Пищевые волокна растительного происхождения для детоксикации пищевых систем представлены на рис.38.

Рисунок 38 - Основные типы пищевых волокон

Органолептическая и химическая характеристика полученного коллагенового полупродукта

Постановка эксперимента по исследованию сорбции ионов тяжелых металлов представлена на рис. 39.

Рисунок 39 - Постановка эксперимента по исследованию сорбции ионов тяжелых металлов

Полярограммы сорбции катионов тяжелых металлов в кислой и щелочной средах представлены на рис. 40.

Рисунок 40 - Полярограммы сорбции катионов тяжелых металлов в кислой и щелочной средах

Сорбционная способность гидролизата коллагена в отношении ионов тяжелых металлов показана на рисунке 41.

Рисунок 41 - Сорбционная способность гидролизата коллагена в отношении ионов тяжелых металлов

Гипотетический механизм сорбции ПВЖП ионов свинца показан на рис. 42.

Рисунок 42 - Гипотетический механизм сорбции ПВЖП ионов свинца

Основные выводы и результаты

1. Усовершенствована технология получения коллагеновой субстанции. Проведена гистоморфологическая оценка топографических участков рыбных шкур на примере толстолобика, выявлены особенности локации коллагеновых белков.

2. При действии различных органических кислот (молочная, аскорбиновая, янтарная) выявлены особенности формирования технологических параметров в зависимости от вида сырья, вида органических кислот. Применение органической кислоты позволяет получать дисперсию с влажностью 96,3%, содержанием белка 3,12%, в том числе коллагенов 87%, и водородным показателем 5,8.

3. Методами термогравометрии (ТГ) и дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) установили температурный придел денатурации рыбных коллагенов при 43.13 С°.

4. Характеристики коллагена Proficoll® доказывают его применимость в медицинской, косметической и пищевой промышленности.

5. Проведены опыты in vivo при использовании в косметической (кожа, волосы), медицинской (ранозаживление, нефрология, проктология) и
   пищевой промышленности.

6. Доказана перспективность получения и применения высокомолекулярного коллагена для получения продуктов медицинского, косметического направления и получения пищевых продуктов профилактического и лечебного назначения.

Список использованных источников

1. Antipova, L. V. A study of the use of modified collagen of freshwater fish as a material for personal care products / Antipova, L.V., Storublevtsev S.A., Titov S.A., Antipov S.S., Khatkhokhu M.G., Bolokov M.S., Loboda V.V. // В книге: Wound Healing. Edited by Muhammad Ahmad. - London - 2020. - C. 17-31.

1. Branden, C, Tooze J. Introduction to Protein Structure. — New York, London: Garland PubL, Inc., 1991. - p.361.

2. Brown, F. J., Cjerassi С // J. of Am. Chem. Foe. — 1980. — 2. — 102. Burgeson, R. E., Mayne R. Structure and Function of Collagen Types. — Orlando: Academic Press, FL, 1987.

3. Characterization of Collagen from Different Discarded Fish Species of the West Coast of the Iberian Peninsula / C. G. Sotelo, M. B. Comesana, P. R. Ariza [et al.] // J. of Aquatic Food Product Technology. — 2016. — 25(3). — P. 388...399,DOI:10.1080/10498850.2013.865283.

4. Creighton, T. E. Proteins, 2nd ed. — NY: W. H. Freeman & Co., 1991.366

5. De Grado, W. F. // Adv. Prot. Chem. — 1988. — V. 39. — P. 1.

6. Endo, A. Hovel collagenase discolysin and production method there of //Biotechnol. adv. — 1987. — 5.— Nr. 11. —P. 158.

7. Eyre, D. R. Collagen: molecular diversity in the body body's protein scaffold // Science. — 1980. — 207. — P. 1315... 1322.

8. Fleischmajer, R., Olsen B. R., Kuhn K. (eds). Biology, Chemistry and Pathology of Collagen. — New York: New York Academy of Science, 1985. — P. 1...537. 

9. Heller, S. R., Milne G. W. A. Library of Congress Cataloging in Pub lication Data, EPA/NIH Mass Spectral data base. — Washington: V. S. Go vernment Printing Office, 1978.

10. Hydrolysates of Fish Skin Collagen: An Opportunity for Valorizing Fish Industry Byproducts / M. E. Blanco, J. A. Vazquez, R. I. Perez-Martin [et al.] //Marine Drags. — 2017. — 15:5(131), DOI:10.3390/mdl5050131.

11. King, N. L. Thermal Transition of ovine connective tissues // Meat Sci. — 1987. — № 20. — P. 25...37.

12. Kopp, J., Bonnet M. Stress — strain and isomeric tension measure ments in collagen // Advances in Meat Research. Vol. 4: Collagen as a Food; ed. A. M. Pearson, T. R. Dutson, A. J. Bailey. — New York: Van Nostrand Reinhold, 1987. —P. 163...185.

13. Millon, J., Orus R. Rilam matiere en tanherie Fechnicuir. — 1983. — N2. —P. 11...16.

14. Parry, D. A. D., Creamer L. (eds). Fibrous Proteins, Scientific, Indus trial and Medical Aspects. — London: Academic Press, 1979. — Vols I & II.

15. Perutz, M. F. Protein structure. — NY: W. H. Freeman & Co., 1992. 397.

16. Preparation and functional evaluation of collagen oligopeptiderich hydrolysate from fish skin with the serine collagenolytic protease from Pseudoalteromonas sp. SM9913 / Chen Xiu-Lan, Peng Ming, Li Jing [et al.] // Scientific Reports. — 2017. — 7: 15716, DOI:10.1038/s41598-017-15971-9.

17. Skierka, E.; Sadowska, M./ The influence of different acids and pepsin on the extractability of collagen from the skin of baltic cod (Gadus morhua).// FoodChem. 2007, 105, 1302-1306.

18. Адгезия тромбоцитов в цельной крови к коллагену: простой и быстрый количественный метод исследования / В. С. Гуревич, И. А. Михайлова, В. И. Иванов [и др.] // Лабораторные новости Дальнего Востока. — 1999. —№2. —С. 15...21.

19. Антипова Л.В., В сборнике: Разработка новых влагопоглощающих материалов из коллагена пресноводных рыб. [Текст] / Антипова Л.В., Сухов И.В. // Материалы LVII отчетной научной конференции преподавателей и научных сотрудников ВГУИТ за 2018 год в 3 частях.- 2019.-С. 59-60.

20. Антипова Л.В.,Способ обработки коллагена пресноводных рыб для получения материала с высокой влагопоглощающей способностью [Текст] / Антипова Л.В., Титов С.А., Сухов И.В. // «Известия вузов. Пищевая технология». -2019. - № 1 (367). - С. 57—60.

21. Антипова, Л. В. Выделение из шкур прудовых рыб биопрепаратов гиалуроновой кислоты и коллагена / Л. В. Антипова, Г. А. Хаустова, А. В. Алехина // Материалы II научно-практической конференции молодых ученых «Современные проблемы и перспективы рыбохозяйственного комплекса». — 2011. — С. 270.. .273.

22. Антипова, Л. В. Использование новых технологий для получения кожевенного полуфабриката из шкур прудовых рыб / Л. В. Антипова, О. П. Дворянинова, Л. П. Чудинова // Материалы I Всероссийской научно- практической (заочной) конференции «Актуальные вопросы развития современной науки, техники и технологий». — М., 2009. — С. 11... 13.

23. Антипова, Л.В. Коллагены: источники, свойства, применение / Антипова Л.В., Сторублевцев С.А., Антипов С.С. // Санкт-Петербург: ГИОРД, 2019.

24. Антипова Л.В., Перспективы применения влагоемких материалов из шкур пресноводных рыб для спортивной экипировки. [Текст] / Антипова Л.В., Сухов И.В. Тычинин Н.В.// В сборнике: Материалы LVII отчетной
    научной конференции преподавателей и научных сотрудников Вгуит – 2018 год в 3 частях. Под редакцией О.С. Корнеевой. - 2019. - С. 41.

25. Антипова, Л. В. Проблемы и перспективы рационального использования шкур прудовых рыб в качестве сырья для кожевенной промышленности / Л. В. Антипова, О. П. Дворянинова, Л. П. Чудинова // Материалы конференции «Совершенствование техники, технологии и методов управления на предприятиях пищевой и перерабатывающей промышленности». — Воронеж, 2009. — С. 94.. .96.

26. Антипова, Л. В. Свойства препаратов функциональных биополимеров рыбного происхождения / Л. В. Антипова, О. П. Дворянинова, С. А. Сторублевцев [и др.] // Вестник ВГУИТ. —№ 3. — 2014. — С. 103...106.

27. Антипова, Л.В. Рыбные коллагены: источники, свойства и применение [Текст] / Л.В. Антипова, С.А. Сторублевцев, С.Б. Болгова, И.Ю. Жданова, К.В. Майорова // Сырье и упаковка для парфюмерии, косметики и бытовой химии. - 2015. - №7 (169) - с. 15-17. 

28. Батечко, С. А., Ледзевиров А. М. Коллаген «Invitaskinbeauti» Новая стратегия восстановления здоровья. — Одесса: Хоббит плюс, 2007. —224 с.

29. Васильев, М.П. Коллагеновые нити, волокнистые и пленочные материалы: Монография. - Спб.: СПГУТД, 2004. - 397 с.

30. ГОСТ 23041-78 Мясо и продукты мясные. Метод определения оксипролина. - Введ. 1979-01-01. - М.: Стандартинформ, 2010, с. 6.

31. ГОСТ 24160-2014 Методы определения влагоемкости и водопоглощаемости [Текст] / Москва. - Стандартинформ. - 2015.

32. ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96). Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований [Текст] — М.: Изд-во стандартов, 1999.

33. Гремлих, Ганс-Ульрих Язык спектров. Введение в интерпретацию спектров органических соединений [Текст]. / Ганс-Ульрих Гремлих - ООО «Брукер Оптико», 2002. - 94 с.

34. Кантор, Ч. Биофизическая химия / Ч. Кантор, П. Шиммель: в 3 т. — М.:Мир, 1982.-140 с.

35. Кащенко, О.А. Изучение условий сорбции летучих веществ ароматов СО2-экстрактов на препаратах животных белков / Кащенко О.А., Данылив М.М., Антипова Л.В., Поленов И.В. // Современные наукоемкие технологии - 2010 - №3 - С. 40-41.

36. Коллагеновые материалы, пленки и способы их изготовления [Текст]: пат. 2455322 РФ: МПК: C08J5/00, C08J5/18, В32В9/02, B05D3/00, В29С67/20, C12N5/00, C12N11/04, А61К9/70 / Паукшто М. В., МакМартри Д.X., Фуллер Д. Д., Бобров Ю. А., Кирквуд Д. И.; заявители и патентообладатели КоллЭнджин, Инк., Зе Боард оф Трастис оф зе Лилэнд
    Стендфонд Юниор Юриверсити - №2009125186/05; заявл. 05.12.2007; опубл.
    10.07.2012.

37. Курьянова, Н.Х Методы исследования мяса и мясных продуктов / сост. Н.Х. Курьянова - Димитровград: ТИ(ф)УГСХА, 2013.-71 с.

38. Кучменко, Т.А. Контроль качества и безопасности пищевых продуктов, сырья [Текст]: лабораторный практикум: учеб.пособие / Т.А. Кучменко, Р.П. Лисицкая, П.Т. Суханов, Ю.А. Асанова, Л.А. Харитонова // Воронеж, гос. технол. акад., ООО «СенТех». - Воронеж: 2010.- 116 с.

39. Кучменко, Т.А. Химические сенсоры на основе пьезокварцевых микровесов. В монографии Проблемы аналитической химии. Т. 14/ Под ред. Ю.Г. Власова. - Воронеж - 2011.- С. 127-202.

40. Мазуров, В. И. Биохимия коллагеновых белков. — М.: Медицина, 1974. — 248 с.

41. Метревели, И.О. Изучение влияния ультрафиолетового излучения на коллаген методами микрокалориметрии и электронного парамагнитного резонанса [Текст] / И.О.Метревели, Л.О. Иамичейшвили, К.К. Джариашвили, Э.И. Чикваидзе, Г.М. Мревлишвили // Биофизика. — Вып. 51.-2006-№ 1.-с. 39-43.

42. Миронов, В.Л. Основа сканирующей зондовой микроскопии [Текст] / В.Л. Миронов - ИМФ РАН, г. Нижний Новгород, 2004. - С.114.

43. Николаев, А. В. Коллаген и регенерация (основные механизмы лечебного действия препаратов коллагена) / А.В. Николаев, А. Б. Шехтер // Экспериментально-клинические аспекты применения биологических полимеров в медицине. — М., 1981. — С. 11... 13.

44. Николаева, Т.Н. Структурно-термодинамические аспекты упаковки коллагеновых фибрилл [Текст] / Т.Н. Николаева, Е.И. Тиктопуло, Е.Н. Ильясова, СМ. Кузнецова Биофизика, 2007, № 5, с. 899-911.

45. Николаева, Т.Н. Термодинамические характеристики коллагеновых фибрилл, реконструированных in vitro при разных температурах и концентрациях [Текст] / Т.Н.Николаева, Е.И. Тиктопуло, Р.В. Полозов, Ю.А. Рочев Биофизика, 2007, №2, с. 261-267 (62).

46. Новикова, И.В. Разработка технологии напитков типа "Шорли" с коллагеном / Новикова И.В., Антипова Л.В., Романюк Т.И., Бовва О.А., Кудряшов М.С. - Вестник Воронежского государственного университета
    инженерных технологий. - 2020. - Т. 82. - № 3 (85). - С. 50-57.

47. Рубин, А. Б. Биофизика: в 2 т. — М.: Книжный дом «Университет», 1999. — Т. 1. 277.

48. Серов, В. В. Общая патология человека / В. В. Серов, Д. С. Саркисов, А. В. Смольянников. — В 2 т. — М.: Медицина, 1989. — Т. 1. — 657 с. 282.

49. Серов, В. В. Соединительная ткань / В. В. Серов, А. Б. Шехтер. — М.: Медицина, 1981. — 278 с. 283.

50. Степанов, В. М. Молекулярная биология. Структуры и функции белков. — М.: Высш. школа, 1996. 294.

51. Страйер, Л. Биохимия. В 3 т. Т. 3 / пер. с англ. М. Д. Гроздовой, А. Н. Колчинского ; под ред. С. Е. Северина. — М.: Мир, 1985. — 397 с. 304.

52. Сысоев, В.В. Введение в линейное программирование: Методические указания по курсу «Математические методы и модели в расчетах на ЭВМ» [Текст] / В.В. Сысоев. - Воронеж. Технол. Ву-п/ - Воронеж, 199О.-27с. (66) (71).

53. Чернавский, Д. С. Белок — машина. Биологические макромолекулярные конструкции / Д. С. Чернавский, Н. М. Чернавская. — М.: Изд-во МГУ, 1999.345.

54. Шульц, Г. Е. Принципы структурной организации белков / Г. Е. Шульц, Р. X. Ширмер. — М.: Мир, 1982. 35